一、实验目的
1．掌握二氯荧光素最大激发波长和最大发射波长的测量方法；许延网络公关
2．学会辩别荧光物质的分子荧光峰和拉曼散射峰；
3．熟悉岛津RF-5301（日立F-4500）荧光分光光度计的定性扫描方法及定性测量软件数据处理操作。
二、实验原理
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任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱。由于斯托克斯位移，荧光发射波长总是大于激发波长。在一定光源强度下，若保持激发波长λex不变，扫描得到的荧光强度与发射波长λem的关系曲线，称为荧光发射光谱，它表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度；反之，保持λem不变，扫描得到的荧光强度与λex的关系曲线，则称为荧光激发光谱，它可以反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长值，所以，可用它来鉴别各种荧光物质。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。同一荧光物质的分子荧光发射光谱曲线的波长范围（和最大发射波长）不因它的激发波长值的改变而位移，由于这一荧光特性，如果固定荧光发射波 长（λem），然后改变激发波长（λex），并以荧光强度F对激发光波长λex绘图即获得激发光谱曲线，从中能确定最大激发波长（λex）。反之，固定激发波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，即得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。
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三、仪器和试剂
1.仪器荧光分光光度计（岛津RF-5301，日立F-4500）。它的主要技术指标如下：测量波长范围：220-900nm，
（200-900nm）、光源：脉冲氙灯、测量模式：激发光谱，发射光谱，波长同步光谱，测量方式：定性、定量、三维扫描、荧光动力学四面通石英比皿一个（10mmx10mm）、25mL具塞比管、移液管、吸耳球、洗瓶、吸水纸
2.试剂(1)二氯荧光素标准溶液a储备标准液(25mg/mL)：称取0.0125g二氯荧光素（A.R），用0.01mol•L
非你莫属之藏龙卧虎－1NaOH溶液溶解后移入500mL容量瓶中并用0.10mol•L－1NaOH稀释至刻度。b工作标准液
(0.10mg/mL)：取上述储备溶液10.00mL于一500mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀，配制成
0.50mg/mL溶液。再移取0.50mg/mL溶液10.00mL于一50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀。
（2）1.0mol•L－1NaOH
四、实验步骤
1.取25mL具塞比管，加入上述二氯荧光素工作标准溶液5.00mL，然后加入1.0mol•L1NaOH1.0mL，tcl笔记本电脑
用蒸馏水稀释到刻度摇匀。
2.打开计算机、打印机和荧光光度计主机，预热5分钟。
3.对荧光光度计进行仪器初始化。
4.依次在激发波长值分别为340nm/350nm/360nm，波长扫描范围为200-750nm，激发和发射波长狭缝宽
度分别为5nm，响应时间为10nm，扫描速度为1200时扫描二氯荧光素的各发射光谱图，并且通过叠加的三份谱图分析和确定二氯荧光素的荧光发射峰。再确定最大发射波长值。同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。
5.同理，固定最大发射波长扫描激发光谱图。从图中确定二氯荧光素的荧光激发峰。再确定最大激发波
长值。
数据及处理分别根据各自峰的特点，确定二氯荧光素最大激发波长、最大发射波长及指出拉曼峰、瑞利峰、双倍频峰。
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