班级：生工1005 学号：020******* 姓名：朱同辉
实验目的：
2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义；
3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法；
4.学习酶活力的计算方法。
实验原理：
盐析法
在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。浙江同志
原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜；
②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。
盐析效果： 二价离子 > 一价离子
离子半径小 > 离子半径大
船用接触器阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-
蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn 经验式来表示：
式中：S —蛋白质的溶解度 I —离子强度
β—常数，与温度和pH 有关
Ks —盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关 其中I 根据下式计算：
式中：ci —i 离子的浓度（mol/L ） zi —i 离子所带的电荷 蛋白酶活力的测定
福林（Folin ）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。
蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算
K —在酪氨酸标准曲线上O.D 值为l 时酪氨酸的微克数（μg ），K 值为
108.53
680
D .O N K 10
4
⨯⨯⨯=酶活力I
K S log s -β=2
i i z c 2
1I ∑=
N—酶液稀释倍数
4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以4
10—反应时间为10 min
参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍
实验步骤：
1）蛋白质盐析
刘瑞龙分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min，使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀完全。
将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心于10℃，10,000 r/min 离心20 min。
将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别测定酶活（u/ml），即为该酶的溶解度S。
2）蛋白酶活力的测定：
1.将2%酪蛋白溶液40℃预热3-5min
2. 取3支试管编号0、1、2，分别吸取待测酶液1ml放入试管中，40℃水浴中预热1-2min
3.往0号试管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支试管中加入2%酪蛋白1ml，计时摇匀，40℃反应10min
4.往1、2号试管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，摇匀，取出3支试管静置10min
5. 另取3支试管，分别吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，于40℃水浴中保温20min显。
6.以0号管为对照，在波长680nm处测定1、2号管的吸光度，求出平均值。
3）蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算
计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液酶活残留，并填表。
以log S为纵坐标，I为横坐标作图，将直线部分线性回归，求出Ks和β的数值，建立起蛋白酶的盐析曲线。
数据记录及实验结果：
编号O.D680平均值上清液体积/mL
原酶液1 0.388
0.406 \ 2 0.424
饱和度20% 1 1.069
1.121 55.8
2 1.173
饱和度30% 1 0.819
0.821 55.4 2 0.823
饱和度40% 1 0.952
0.985 53.0 2 1.018新世纪健康饮食
饱和度50% 1 0.021
0.220 56.2 2 0.418
饱和度60% 1 0.062
0.051 58.5 2 0.040
饱和度70% 1 0.091
儿童
0.151 62.1 2 0.211
编号(NH4)2SO4浓度mol/L 离子强度I 上清液酶活蛋白酶溶解度S logS
氨肽素
原酶液0 0 \ \ \ 饱和度20% 0.82 2.46 4866 271522.8 5.43
饱和度30% 1.23 3.69 7128 394891.2 5.59
饱和度40% 1.64 4.92 6414 339942.0 5.53
饱和度50% 2.05 6.15 955 53671.0 4.72
饱和度60% 2.46 7.38 221 12928.5 4.11
饱和度70% 2.87 8.61 328 20368.8 4.31
讨论：
通过本次试验，初步掌握了蛋白酶盐析沉淀及其酶活测定的方法。在开始实验时，对实验的整体思路没有理解，仅仅盲目的按照步骤进行，导致浪费了很多时间，并且实验结果不理想。希望老师能在实验的前一周把讲义发给大家，进行充分的预习，对提高实验效率和准确度会有帮助。
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