【目的要求】
【实验原理】
薄层层析是一种微量而快速的层析方法。最早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化铝薄层分离了植物提取液。层析是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。
为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂，在吸附刘或支持剂中添加了适合的粘合剂再涂布，可使薄层粘牢在玻璃板（或涤纶片基）这类基底上。
硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12%-13%的石膏（CaSO4）,它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层使不同的物质得以分离。例如糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关， 经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖>己糖>双糖>三糖。若用硼酸溶液市制硅胶G可改进分离效果。对己分开的斑点显，而将与它位置相当的另一个未显的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法各组分的含糖量。
薄层层析一般采用上行法，在具有密闭盖子的玻璃缸中进行，溶剂倒于缸底，简单地将薄板放入即可。保证层析缸内有饱和的蒸气是实验成功的关键。保证措施是在层析缸内壁衬一层浸湿溶剂的滤纸或缩小层析缸的容积。因为层析时，溶剂会从薄层上蒸发，样品移动到一定距离的时间就会处长。若所用溶剂系统由几个成分组成，挥发性较大的成分首先蒸发，就会使混合溶剂的组分改变，而溶剂的蒸发从薄板的中央向两边递减，致使溶剂前沿呈弯曲状，结果往往是使两边的Rf值大于中央位置的Rf值。
薄层层析与其它方法比有明显的优点：层析时间短，可以分离多种化合物，用样品量少（微克级），与纸层析相比要灵敏10-100倍，观察结果方便，显方法甚至可以用腐蚀性显剂。
【实验用品】
1.器材：层析柱，铁架台及蝴蝶夹，部分收集器，恒流泵，喷雾器，层析缸，恒温烘箱，电
吹风，毛细玻璃管，离心机，离心管，研钵，玻璃板等
2.药品试剂：硅胶G，果汁(自制)，1%标糖溶液（葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、棉籽糖、
木糖等）、混合糖溶液、显剂（苯胺、二苯胺、丙酮、磷酸），展开剂（正丁醇：乙酸乙酯：
咪唑啉异丙醇：冰乙酸：水=2：6：6：4：1）
【实验过程】
1、 制备硅胶G薄层板
取硅胶G粉3.0g研钵中，加9mL 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，调匀后铺于洁净平整的玻板上，铺层后自然风干、固结，再于105oC烘箱中烘干活化1h。取出后可用，亦可贮于干
燥器中备用。薄层表面要求平整，厚薄均匀。
2、 糖在硅胶G薄层上的分离
选制备好的薄板一块，在距底边1.5～2cm的位置用铅笔轻画直线，选6个点，相互等距（大于1cm）。用毛细管分别点上不同的糖样品(点1~2次即可)，斑点直径不超过3mm。待薄层上样品自然干燥后，将薄板置于盛有层析溶剂的层析缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板项端约1cm处时取出薄板，前沿作一记号，吹干，除尽溶剂后均匀地喷上苯胺-二苯胺显剂，100oC烘烤5~10min。
3、 观察记录。
绘图，并记录各斑点的位置、颜，测量斑中心至起点以及展开剂前沿至起点的距离，计算Rf值。根据样斑的大小形状、颜及深浅和Rf值分析果汁中的糖分。
【注意事项】
1. 调制硅胶G成糊状物，稀稠合适，铺板迅速，均匀，表面平整。特别是点样端，要铺满玻板。
2. 点样时，样斑直径控制在3mm以内，样斑间距至少1cm;
3. 展开时，样品不能浸到展开集中；
4. 显剂中的苯胺有毒，使用时应在通风柜中，避免与皮肤接触。
【实验二】 牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备
【目的要求】
非人类学习、掌握盐析法、等电点沉析分离的基本操作技术。
【实验原理】
乳蛋白素广泛存在于乳品中，是乳糖合成所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，酪蛋白在pH为4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此性质，可现将加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来，酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将除掉酪蛋白的滤液pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质可随澄清液除去。再经过一次pH沉淀后，即可得粗粗乳素蛋白素。
蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当其溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的正负电荷数目相等而呈电中性，此时溶液的pH值称为该物质的等电点。生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离。
【实验用品】
1、器材：烧杯（100 mL、250mL）、玻璃棒、滴管、量筒、低速离心机、50ml离心管、水浴锅、真空泵、布氏漏斗、抽滤瓶、精密pH试纸、酸度计、表面皿、电子天平等；
2、试剂：脱脂鲜牛奶、硫酸钠、0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH、95%乙醇、浓盐酸、标准缓冲溶液等。
【实验过程】
步骤： | 实际操作及现象： |
①将鲜牛奶50 mL于40℃左右水浴搅拌加热。 | 100mL烧杯1个 |
小哥小②在搅拌下慢慢加入10g无水硫酸钠（约10min内分次加入）。之后继续搅拌10min。 | |
③将上述混合液冷至室温，离心（3500r/min）15min。或用细布过滤。分别收集沉淀和清液，得酪蛋白粗制品。晒黑族 | 50mL离心管2个 |
④在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻。将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇洗沉淀2次。抽干。 | |
⑤将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。 | |
⑥将步骤③所得清液至于100mL烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计牡荆子以浓盐酸调整pH至3±0.1。 | 滴瓶 |
⑦将上一步骤混合液倒入离心管中，5000r/min 离心15min，倒掉上层液。 | |
⑧在离心管中加入10mL去离子水，震荡悬浮，并以0.1mol/LNaOH调pH至8.5～9.0。 | |
⑨上述溶液5000r/min 离心15min，上层液倒入烧杯中。 | |
⑩一边搅拌，一边利用pH计以0.1mol/L盐酸调整pH至3±0.1。5000r/min 离心15min，弃上清。沉淀取出干燥，并称重。 | |
准确称量，计算含量和收率。 含量=酪蛋白g/100mL牛乳 测得含量 理论含量 收率= ×100% | |
| |
【注意事项】
1、硫酸钠要少量多次加入，动作要缓慢，不可操之过急一次大量加入。
2、离心前温度一定要降至室温。
【思考题】
1、如何提高酪蛋白的收率？
【实验三】 硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质
【目的要求】
1、了解盐析法分离血清中的主要蛋白质的基本原理；
2、掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术。
【实验原理】
盐析是最常用分离蛋白质的方法，是利用各种蛋白质所带电荷不同、相对分子质量不同，从而在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此一个含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉析下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。一般粗提取物常用它进行粗分离。常用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等，其中最常用的是硫酸铵。用盐析法分离蛋白质，简便安全，而且所得的蛋白质并不丧失活性，是分离纯化中最佳的一种方法。在实际操作时，可先把蛋白质溶液调至等电点，使其溶解度达到最低，然后加入粉末固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液，并达到一定浓度。这时蛋白质即从溶液中析出，经过滤或离心，透析去盐，即可获得产品。
【实验用品】
1、材料：新鲜动物血浆或血清（无溶血现象）100mL
2、试剂：pH7.2饱和硫酸铵溶液、0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）其配制方法如下：
配A液 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液(称取磷酸氢二钠71.64g加去离子水精确配1000mL)；
配B液 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(先称取磷酸二氢钠31.21g加去离子水精确配100mL)；
取A液约72mL，取B液约28mL，然后将这两种溶液边混合边用高精度pH试纸检测，调配成约100mL浓度为0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲溶液备用。
3、器具：离心机、大烧杯（≥500mL）、烧杯（250mL）、高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。
【实验过程】
1、清蛋白与球蛋白分离
步骤 | 实际操作及现象 |
①取100mL血浆或血清置于500mL烧杯中，加PBS 100mL搅拌10min。 | 500mL烧杯1个 偶合常数 |
②在搅拌下慢慢滴加200mL pH7.2饱和硫酸铵溶液。 | |
③加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌20~30min以充分沉淀球蛋白。 | |
④离心（3500r/min）20min，弃去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白。 | 300mL离心管 |
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2、各种球蛋白的分离
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