实验一蛋白质的沉淀与变性、染料结合法测定蛋白质含量 蛋白质的沉淀与变性
一、目的要求
2.进一步掌握蛋白质的有关性质；
3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、原理
蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或者与某些试剂结合成不溶性盐类后，可以从溶液中沉淀析出。此现象叫蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应分为两类。 1.可逆沉淀反应：此时蛋白质分子的结构并未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，
蛋白质沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性，如大多数蛋白质的盐析作用或在低用温下乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。这是制备酶、激素等蛋白类药物时常用的方法。2.不可逆
沉淀反应，蛋白质分子内部结构特别是空间结构遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。如重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱和加热等反应均属此类。
三、沉淀反应
1.蛋白质的盐析作用
（1）原理
一般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，因此，向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即从溶液中沉淀析出，此现象称为盐析。盐析作用与两种因素有关：①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解，因此蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如清蛋白）易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
（2）器材与试剂
器材： 滴管 烧杯、滤纸、药匙、漏斗 玻棒。
试剂：
○1蛋白质溶液：鸡蛋清。
○2饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100mL加硫酸铵至饱和。
○3硫酸铵结晶粉末。
（3）实验方法
1)取鸡蛋清约5mL于一烧杯中，加等量(5mL)饱和硫酸铵溶液(此时硫酸铵浓度为50%饱和)，搅拌均匀，即有蛋白质析出，静置数分钟，用滤纸过滤，沉淀即为卵球蛋白。滤液若不澄清可重复过滤至澄清。
2)倒出少量沉淀于另一烧杯中，加少量水，观察沉淀是否溶解。 3)将析出卵球蛋白后的滤液装入另一烧杯中，再加入固体硫酸铵后达到饱和，观察有无沉淀析出，若有沉淀，即为卵清蛋白。
4)取出部分清蛋白沉淀加少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。
2.重金属盐类沉淀蛋白质
(1)原理
在蛋白质溶液中，当溶液pH在其等电点以上时，重金属盐类(如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，因此常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐（如硫酸铜或者醋酸铅）沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。
(2)器材和试剂
器材：试管、滴管
试剂
①.蛋白质溶液：与实验一：蛋白质性质（一）的双缩脲反应相同。
②.5% CuSO
4
溶液。
③ 3% AgNO
3
溶液。
tronatic motion④.0.01%NaOH溶液。
⑤.10% 醋酸溶液。
(3)实验方法
取4支试管，按表1加样。
表1
管号
试剂
1 2 3 4
蛋白质溶液(滴) 2 2 2 2
0.01%NaOH溶液（滴） 1
5%CuSO
4
溶液（滴） 1
10%醋酸溶液（滴） 1
3%AgNO
3
溶液（滴） 1 1 1
现象
加毕摇匀，观察各管中变化，记录结果并解释原因。若在1、2两管中加入过量CuSO
4及AgNO
3
试剂，有何结果？观察并记录之。
3.有机溶剂沉淀蛋白质
(1)原理
蛋白质不溶于某些有机溶剂（如乙醇、丙酮等），主要因为乙醇等有机溶剂能使蛋白质胶体颗粒脱水，降低其在水溶液中的稳定性。若向蛋白质水溶液中加入乙醇使达到一定浓度时，则蛋白质沉淀析出，且沉淀不同蛋白质所需乙醇浓度也不同。溶液中若加少量中性盐(如NaCl)，沉淀将更加迅速和完全。
孕妇餐厅(2)器材和试剂
器材：试管、药匙、滴管。
试剂：○1蛋白质溶液：与实验一：蛋白质性质（一）的双缩脲反应相同；
○295%乙醇；
○3固体氯化钠。
（3） 实验方法
○1取一支试管，加1mL蛋白质溶液，再加少许NaCl晶体（火柴头大小），摇匀使溶解。
○2再向试管中徐徐加入2 mL 95%乙醇，强力振摇，观察有无沉淀析出。
小学品德与社会论文4 加热沉淀蛋白质
（1）原理
大多数蛋白质在加热时，由于空间结构被破坏而丧失其稳定性，因此变性凝固。蛋白质的热变性作用与加热时间平行，并随温度的升高而加快。短时间加热可能不引起凝固。加热
时，盐类的存在及溶液酸碱度对蛋白质的凝固有很大影响。处于等电点状态的蛋白质加热时凝固最完全、最迅速。在强酸、强碱溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热也不凝固。但溶液中若有中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。
（2）器材与试剂
器材：试管、滴管
试剂:
①蛋白质溶液：与蛋白质的性质（一）的双缩脲反应相同。
②1%醋酸溶液。
③10%醋酸溶液。
④10%NaOH溶液。
⑤饱和NaCl溶液。
（3）实验方法
取5支试管，下表2加样。
表2
加毕，摇匀，将5支试管同时置于沸水浴中加热，并观察现象，解释原因。
四 、实验注意事项
1做蛋白质盐析实验时，应先加蛋白质溶液，后加饱和硫酸铵溶液。
2固体硫酸铵若加至过饱和时有结晶析出，勿将其与蛋白质沉淀混淆。
蛋白质含量测定----考马斯亮兰法（Bradford法）
一、目的要求
1学习用染料结合比法测定蛋白质含量的原理和方法。
2了解染料结合比法测定蛋白质含量的优缺点。
二、实验原理
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（λmax），由465nm变为595nm，溶液的颜也由棕黑变为兰。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
三、试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用γ—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml 的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管16支
四、操作方法
1. 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
ZHOULIAN（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
注意：不可使用石英比皿（因不易洗去染），可用塑料或玻璃比皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染。塑料比皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
出井伸之
考马斯亮兰法实验表格：
（3）用标准蛋白质量（ g）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
2.样品中蛋白质的提取：准确称取约 1g 绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入2ml 蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到50ml容量瓶中，再用蒸馏水清洗研钵，洗涤液集中于容量瓶中，放置0.5~1小时以充分提取，用磷酸缓冲液定容，然后离心（4000r / min , 10min ) ，上清液为蛋白质提取液。
实验二酶的性质
一、目的要求
1 .加深对酶的性质的认识。
2 .学习和掌握检查酶性质的方法及其原理。
二、内容
本实验由温度对酶活力的影响、pH对酶活力的影响、酶的激活及抑制、酶的专一性四组实验组成。
1.温度对酶活力的影响
(1) 原理
温度对酶活性有显著影响，在一定温度范围内，温度升高酶促反应加快，反之则降低。当温度升高至某一特定值时，酶活性最高，此温度称为该酶的最适温度。高于此温度，酶蛋白逐渐变性，逐渐失活，反应速度下降。
本实验以唾液淀粉酶在不同温度下对淀粉的作用为例，观察温度对酶活性的影响，淀粉的水解程度用其与碘液的呈反应加以区别。
特奥(2) 器材与试剂
器材：试管、试管架、 吸管 洗耳球、恒温水浴、电炉、温度计、反应板、烧杯、滴管试剂：
0.2%淀粉溶液（含0.3%NaCl）溶液 （需新鲜配制）。
稀释的唾液：漱口后收集唾液，用小漏斗加少量脱脂棉过滤，滤液稀释十倍备用。
碘化钾-碘溶液：称20g碘化钾和10g碘，溶于100m L蒸馏水中，贮于棕瓶中，使用前稀释十倍。
(3) 实验方法与结果观察
1）将稀释的唾液取一部分煮沸。
2）取3支试管，按表1加样。
表1
试剂 1 2 3
0.2%淀粉（mL） 1.5 1.5 1.5
稀释唾液（mL） 1 1
煮沸过的稀释唾液（mL） 1
放置条件（10min）37℃冰浴37℃
3）取出三支试管，将2号管溶液分为两半，取其中的一半做如下实验：从三支试管中各取出溶液一滴于反应板上，加上一滴碘化钾-碘溶液，观察呈现象，记录结果，解释原因。
4）将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴，继续保温10分钟后，再用碘液检测。解释原因。
2.pH对酶活性的影响
(1)原理
pH值直接关系到酶蛋白及底物分子的解离和带电状况，影响酶和底物的结合，从而影响酶促反应速度。当溶液的pH达到某一特定值时，酶的活力最高，该pH为最适pH，每种酶都有其特定的最适pH。
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