鲍鱼酶的制备和应用试验
胡远皆 尹长松 孙育平
(上海水产大学渔业学院，上海200090)
提 要 从鲍鱼的消化器官中提取裂解酶，比较了胃、肠和消化腺中酶的活力，并用于海带、裙带菜和条斑紫菜的单细胞分离。结果表明：三种器官中裂解酶的活力依次为消化腺>肠>胃，用以酶解上述三种藻类组织的单细胞，得率分别为8.7×106i/g、7.2×106i/g、4.6×106i/g。关键词 鲍鱼 酶 酶解活力 Preparation and Analysis of Alginate Lyases from Abalone
HU Yuan-jie YIN Chang-song SU N Yu-ping
(Colleg e of Fishery Science of SFU,Shanghai200090)
Abstract T he alginate lyases w as prepared fro m the digestive organs of stom ach,intestine and dig estiv e gland of abalone H aliotis div ersicolor and the enzyme activ ities pr epared fro m different org ans w ere com pared,then the enzymes w ere applied to isolate the unicells fr om L am inar ia j ap onica,Undar ia p innatif ida and Porp hy ra y ez oensis.The results indicated that the enzy matic activity
from dig estive g land w as the highest and that fro m stom ach w as the low est,and the number of unicells iso lated fro m L aminaria j ap onica,Undar ia p innatif ida and Porp hyr a y ez oensis w ere8.7×106g-1,7.2×106g-1and4.6×106g-1respectiv ely.
Key words H aliotis diversicolor Enzym e Enzymatic activity
近几年来，体细胞和原生质体的分离和培养已被应用于大型经济海藻的养殖业中[1-3]，这无论从生产上解决苗种来源的途径或作为选种育种的一个手段来看，都具有一定的现实意义。游离的单细胞通常可以采取机械磨法、愈伤组织和酶解法自藻体获得，但机械法效率低下，愈伤组织的操作较难，而酶解法反应条件温和，能使体细胞受到的伤害降到最低程度，故而它是目前最有效的一种获得细胞的方法。但酶解法中使用的裂解酶多为进口商品，价格昂贵且酶解过程中的最适酶量难以确定。本研究选杂鲍为酶源，对从鲍鱼不同消化器官中制备的裂解酶的活力和蛋白含量进行比较，并以裂解酶酶解不同海藻作应用试验。 材料和方法
1.材料
鲍鱼 新鲜的活体杂鲍(H aliotis diversicolor)，于2000年4月购自上海市四平路曹安水产品市场。
海藻 实验用海带(L am inar ia
j ap onica )、
裙带菜(Und aria p innatif ida )于1998年4月采自山东青岛；条斑紫菜(Porp hyr a y ez oensis )于1999年采自江苏南通，于-20℃下贮藏。
2.方法
公司债权转股权登记管理办法(1)酶的制备 根据海螺酶的提取程序[4]修改为：解剖鲍鱼，取不同消化器官，捣碎后溶解于0.1mol /L 的磷酸盐(pH 7.0)
缓冲液中，先用30%饱和度的硫酸铵盐析，在冰箱中透析过夜，离心(1000r/min,15min)去沉淀，取上清液，加硫酸铵至90%饱和度盐析，透析、离心，得沉淀物，溶解于磷酸盐缓冲液中，再经透析、离心和干燥得酶粉，冷冻保存。
商业街设计理念(2)性质分析 蛋白含量的测定采用
Br adfo rd 比法[5]
(1976)，酶活力的测定采
用Nakada 法[6]
(1967)。
(3)酶解方案 单细胞的制备依据M atsum ura (1998)[7]。取冷冻组织1g ，用剪刀将其剪成1mm 2的小碎片，放入8ml 酶解液中(0.8mol /L 甘露醇,50mM Tris ,1%(w /v )纤维素酶,0.5%(w /v )离析酶R -10,
0.2 ・m l -1鲍鱼酶)，放在摇床上(70r /min )，于黑暗条件下(14℃)酶解6～8h 。然后用100 m 的筛绢过滤去除未酶解的残渣碎片，离心(2500r /min,5min)收集游离的单细胞。
结 果
1.为充分提取所需的鲍鱼酶，取鲍鱼的消化器官胃、肠和消化腺，实验中分别利用单
心理月刊中文网次盐析(90%饱和度)和分级盐析(30%→90%饱和度)沉淀法来制备，测得的蛋白含量见表1。
2.采用分级盐析沉淀法自不同消化器官中制备鲍鱼酶，称重后将所得酶粉溶解于无
菌蒸馏水或缓冲液中，采用Nakada 法测定
表1 不同提取程序中鲍鱼酶的
蛋白含量(mg ・g -1)
244uu
(NH 4)2S O 4饱和度
胃肠消化腺90%23467930%→90%
38
73
124
酶活力，结果见表2。
表2 不同消化器官作为酶源的效果比较
消化器官
重量(湿重g)鲍鱼酶粉(g)得率(%)酶活力( A ・ml -1)
胃230.1140.490.07肠310.2230.710.13消化腺
27
0.409
1.52
0.40
3.以自消化腺中提取的鲍鱼酶分别酶解海带、紫菜和裙带菜，测定完全酶解的时间，通过血球记数计算每克组织得到游离单细胞的数量，结果见表3。
表3 不同实验中海藻组织的酶解效果比较
海藻品种时 间
(h )单细胞数目(i ・g -1)海 带68.7×106紫 菜9 4.6×106裙带菜
7
7.2×106
讨 论
鲍鱼酶制备实验的结果表明，利用硫酸铵的分级沉淀来提取，得到的粗酶液中蛋白的含量远较单次盐析要高，说明要从组织中充分提取裂解酶，以采取分级沉淀法为好。此
图1 未酶解海带组织中的细胞
图2 已酶解而游离的海带单细胞
外，通过比较从鲍鱼的不同消化器官中提取的酶液的活性可知，消化腺为最好的酶源，肠次之，胃最差，而这也正好与鲍鱼在取食海藻时消化酶在不同消化器官中的理论分布相吻合；进而利用从消化腺中提取的消化酶分离不同海藻的单细胞，结果：海带的酶解效果最好(图1、2)，裙带菜次之，紫菜的酶解效果相对较弱。这可能是因为鲍鱼通常是以褐藻如海带、裙带菜为食物，故而消化腺中提取的酶液应为褐藻酸裂解酶。
结果表明，鲍鱼可以作为提取褐藻酸裂解酶的良好酶源，用以分离海藻单细胞，不仅可以为生产上提供苗源和用于选种、育种，而且为开展海藻遗传工程研究提供了新的途径。
红红的樱桃参考文献
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发稿编辑 汤惠明校对 朱选才
(上接第255页)
成活率。采用活体饵料，减少水质污染也是重要因素。此外，还与香鱼苗很少相互残食有关。
野兽与乡巴佬
5.发展前景
香鱼可在溪流、水库、湖泊中用网箱饲养，也可建水泥池或利用废弃的养鳗场，可养水域广阔。香鱼食物链短，用人工配合饲料投喂，饵料来源充足；它的生长迅速，当年11月底育苗，翌年元月中、下旬鱼种出池，再经10个月的饲养，商品鱼规格可达100g左右。商品鱼在日本、台湾省及大陆市场极为畅销，具有很好的市场前景。因此，香鱼养殖可望在提高养殖业经营效益中发挥其一定的作用。
参考文献
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3.曹克驹，李明云.凫溪香鱼繁殖生物学的研究.水产学报, 1982,6(2):107～118.
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人工繁殖及胚胎发育.水产科技情报,1998,25(3):126～129.
发稿编辑 汤惠明校对 朱大白
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