液气分离器
生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。
在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。
在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。小伙伴们，这是一种正确的态度么？
“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。
回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。
将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。
——看的见的问题是态度本身
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体洗涤
包涵体溶解
包涵体复性
包涵体纯化
1、包涵体裂解
教育体制改革
婴儿护理车细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。
细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。
（1）细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml溶菌酶、1 mM MgCl2、20 μg/ml DNase、1mM 高频变压器设计软件PMSF，混均匀，冰上或者室温放置30 min。根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。
（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；
在细胞裂解时应该注意：
a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。
b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲
溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。
2包涵体洗涤
包涵体常用的洗涤试剂：中性去垢剂和还原剂。在包涵体表面吸附着大量的不溶性蛋白，内部成分除了含有重组蛋白，还含有RNA聚合酶、外膜蛋白等杂蛋白，DNA、RNA核酸片段，多糖，脂类等。通过包涵体的洗涤能够除去一些影响重组蛋白活性的杂蛋白，例如，大肠杆菌外膜蛋白OmpT在8 mol/L的尿素中具有蛋白水解酶的活性，可能在包涵体的溶解中降解重组蛋白。
常见的中性去垢剂：TritonX-100，SDS，CTAB，Tween-20，脱氧胆酸盐等，溶解能力比变性剂更加温和。
还原剂：0.1-5mM β-巯基乙醇，二硫苏糖醇，谷胱甘肽等，对于含有半胱氨酸的重组蛋白，还原剂的使用非常重要。
3 包涵体的溶解
变性剂盐酸胍/尿素是包涵体溶解常用的试剂，使蛋白质的氢键发生可逆性的变性作用，破坏蛋白质的折叠。如4-8M的尿素，4-6M的盐酸胍；变性剂在溶解包涵体蛋白时，必须事先检测他们和目的蛋白的兼容性，可以利用层析柱法分离溶解蛋白和变性剂，在分离的同时进行纯化和复性。
还原剂的浓度、作用时间、温度、离子强度要影响变性剂的溶解作用，因此在蛋白质变性时可以加入中性去污剂（SDS、CTAB、Tween 20等）、还原剂（β-巯基乙醇、DTT、GSH等）。
4 包涵体蛋白复性
溶解后的重组蛋白必须正确的折叠才能复性形成具有功能性的蛋白，去除变性剂是影响蛋白复性的因素之一，另外还需考虑pH值、还原剂的存在，宿主蛋白与重组蛋白之间的浓度比对蛋白复性的影响。
复性的技术有：稀释蛋白溶液到接近中性、逐步透析去除变性剂、柱上复性、凝胶过滤层析。
蛋白复性之后可根据其他纯化蛋白的方法进一步纯化蛋白。
5包涵体蛋白纯化
两少一宽复性以后的蛋白纯化方法和可溶性蛋白纯化方法相似，即离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析、硫酸铵盐析沉淀法等。
诉求对象
后记：
每一种蛋白质都有其相应的氨基酸的序列，表现出不同的理化性质，这些物理上的差异性可以作为进行蛋白纯化的线索，具体的实验操作还需多次实践验证，愿这些基础知识能为你的实验操作提供理论支持，我们是北京义翘神州生物，有专业的蛋白表达纯化团队，若有需要请联系我（***************************）。
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