15食安（1）班 张凯
摘要：本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一部分。 关键词：菠萝蛋白酶；透析法；分离纯化；酶活性；
前 言
菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。[1]
利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。[2]
本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步分离纯化及活性测定进行了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。
1 实验材料与仪器
1．1实验材料与试剂
新鲜菠萝，透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），1％酪蛋白，激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)]，10％三(TCA)。
1．2 实验仪器
722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司； 752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；
TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；
D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；
DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；
可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；
AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；
BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；
DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；
HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
2 实验方法
2.1菠萝蛋白酶的粗酶提取
称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2.2盐析
-，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm离心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。
2.3透析
将溶解液装入2.5 cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于 500mL 烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液
至试管中，若出现白沉淀，表示SO42- 未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2.4酶活力测定方法
取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三3mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下 ，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。
实验步骤按照表格中完成。
表1 酶活测定步骤
试剂(ml) | 对照组 | 平行样品1 | 平行样品2 | 平行样品3 |
TCA | 3 | — | — | — |
酶液 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
激活剂 | 0.9 | 0.9 | 0.9 | 0.9 |
酪蛋白 | 1 | 1 | 1 | 1 |
甘肃农业大学工学院37°C准确反应10min |
TCA | — | 3 | 3 | 3 |
A280nm OD值 | 粗提 | — | 0.791 | 0.818 | 0.868 |
盐析 | — | 0.823 | 0.907 | 0.986 |
透析 | — | 0.894 | 0.875 | 0.848 |
| | | | | | 蝙蝠侠前传2黑暗骑士在线观看
2.5蛋白质含量测定方法
将酶液稀释至一定程度，采用考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量（参照附录1）。
3实验结果与分析
3.1 蛋白质含量计算
3.1.1标准曲线的绘制
表X 0-1000ug/ml标准曲线的绘制
管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 协查通报格式5 | 6 |
1000μg/mL牛血清白蛋白 | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸馏水（mL） | 1.0 线上线下作文 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
蛋白质浓度（μg/mL） | 0 | 200 | 40 | 600 | 800 | 1000 |
吸光值（A595） | 0 | 0.157 | 0.245 | 0.391 | 0.535 | 天堂419草坪0.656 |
| | | | | | |
得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000μg/mL标准曲线。
图1 蛋白吸光值标准曲线
3.1.2样品的测定
准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。
3.1.3结果计算
由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（μg/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
查出的蛋白提取液浓度（μg/mL）×定容体积(mL)
样品蛋白含量(μg／g鲜重)＝──────────────────────────────────────
样品重量(g)
样品蛋白质含量（粗提纯）=（517.7×62）/20.00=1604.9（µg/g）
样品蛋白质含量（盐析）=（706×16）/20.00=564.8（µg/g）
样品蛋白质含量（透析）=（1017.7×13）/20.00=661.5（µg/g）
3.2酶活力计算
最后酶活结果取3次重复实验的平均值。
酶液活力（U/mL）= ×稀释倍数
| 步骤 | 空白 | 平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 |
A280nm OD值 | 粗提 | — | 0.791 | 0.818 | 0.868 | 0.826 |
盐析 | — | 0.823 | 0.907 | 0.986 | 0.905 |
透析 | — | 0.894 | 0.875 | 0.848 | 0.872 |
| | | | | | |
粗酶液活力（U/mL）= =8257 U/mL
盐析酶液活力（U/mL）= =9053 U/mL
透析酶液活力（U/mL）= =8723 U/mL
3.3酶比活的计算
酶比活（U/mg· 蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量
粗酶比活（U/mg• 蛋白）爱情不买单 丁酉酉= =5141.8（U/mg• 蛋白）
盐析酶比活（U/mg• 蛋白）= = 16029.3（U/mg• 蛋白）
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议