第38卷第2期东北师大学报(自然科学版)Vol.38No.2 2006年6月Journal of Northeast Normal University(Natural Science Edition)J une2006
[文章编号]100021832(2006)022*******
及亲和配体的研究
马玉芹1，张淑华2，范丽颖2，董 龙3，钱海刚2，丘瑜敏2
(1.长春理工大学材料与化工学院，吉林长春130022;
2.长春理工大学生命科学学院，吉林长春130022;
3.吉林大学环境科学与资源学院，吉林长春130021)
[摘 要] 肌红蛋白主要存在于心肌和骨骼肌中，具有携带氧并将其分配到生物体各个部位的作用.研究表明，心血管病人发病早期，心脏中的肌红蛋白会大量释放入血，使其成为检测急性心肌梗死的良好标志物.采用HR100凝胶过滤层析和DEAE-52离子交换层析技术，从猪心中对肌红蛋白进行了分离与纯化， 后经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，得到了纯化的肌红蛋白，并利用Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒对肌红蛋白特异性亲和配体进行了筛选，最终得到其特异性亲和配体序列，从而使其试剂盒的研制与应用成为可能.
[关键词] 肌红蛋白;HR100；纯化；肽库筛选
[中图分类号] Q513+.4 [学科代码] 180・1710 [文献标识码] A
0 引言
野兔的生活习性
肌红蛋白(myoglobin,MB)是肌组织所特有的一种单肽键蛋白质[1]，主要生物学功能是结合氧并携带氧，是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，在心肌中含量丰富.心肌蛋白是心肌细胞胞浆蛋白，相对分子质量为17800，它在早期心肌缺血的研究中早有报道[2-3].当心肌或骨骼肌有损伤时，肌红蛋白便释放入血液中，使血中肌红蛋白明显增高.如心肌梗死发病后4～12h内，血清中肌红蛋白可达高峰,48h恢复至正常水平[4].因此，肌红蛋白成为近年来测定急性心肌梗死(AM I)的一项重要生物学指标.本文对心肌蛋白的分离纯化及配体筛选进行了具体研究，为其试剂盒的研制与应用打下了基础，使其临床诊断成为可能.
1 材料与方法
多肽药物
1.1 材料，仪器
材料：新鲜猪心(市售).
仪器：组织捣碎机，高速离心机，超声波破碎仪,SL-2层析柜，紫外检测仪，记录仪,TH-1000梯[收稿日期] 2005211221
[基金项目] 吉林省科技发展计划项目(20030450).
[作者简介] 马玉芹(1968-)，女，博士研究生，副教授，主要从事环境生物学研究.
度混合器，凝胶成像仪，电泳装置，超净工作台，干燥箱，高压灭菌锅，移液，分析天平，恒温培养箱等.
低相对分子质量标准蛋白(购于上海生化试剂所),Ph.D -7噬菌体展示肽库试剂盒(购于BioLabs 公司),Sephacryl HR100柱料(购于鼎国试剂公司),DEAE -52柱料(购于鼎国试剂公司)，其他试剂购自鼎国、北京益利试剂公司(均为分析纯).
1.2 方法
1.2.1 组织提取物的制备
将新鲜猪心与一定量的p H 为8.5的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液混合置于组织捣碎机中捣碎3min ，然后将匀浆物于高速离心机(10000r/min )中离心90min ，弃去沉淀，保留上清液.
tl77051.2.2 盐析沉淀
上清液用1mol/L NaOH 调p H 至7.4，后将此上清液用80%的硫酸铵盐析沉淀,10000r/min 离心30min ，去上清，沉淀用少量磷酸盐缓冲液溶解，并置于透析袋中4℃透析过夜.
1.2.3 Sephacryl HR100柱层析
取一定量的透析液上Sephacryl HR100柱，控制流动相的流速，收集相对分子质量为10000～20000的蛋白质.然后将此蛋白提取液用聚乙二醇(PEG )浓缩，并用p H 值为8.5的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液透析过夜.
峰1为高相对分子质量杂质峰；峰2为含肌红蛋白的峰；峰3为低相对分子质量杂质峰.图1 Sephacryl HR 100柱层析过程中样品吸光度变化情况
1.2.4 DEAE -52柱层析
将透析液上DEAE -52柱，然后采用线性梯度法进
行洗脱，洗脱液为0～300mmol/L NaCl 和p H 值为8.5
的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液.分别收集不同峰值的
蛋白组分.
1.2.5 SDS -PA GE 电泳
利用SDS -PA GE 电泳对上述各步骤、不同峰值获
得的样品分别进行鉴定，经与标准蛋白相对照确定肌红
蛋白所在的峰，并对其进行收集，冷冻干燥后得纯品肌
红蛋白.
1.2.6 Ph.D -7噬菌体展示肽库筛选
毛向辉
民主社会主义筛选步骤按Ph.D -7噬菌体展示肽库试剂盒的说
明进行.具体为：将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分
子的平板共同温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特
异性结合的噬菌体.对洗脱的噬菌体进行扩增，然后再
进行下一轮结合/扩增循环，以富集可结合序列.经3轮
淘选后，通过DNA 测序对每个可结合克隆进行定性.2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 Sephacryl HR100柱层析过程中洗脱液出峰情况
在Sephacryl HR100凝胶层析过程中，流出液随时间延长其出峰情况如图1所示.分别收集各峰样品进行电泳.电泳结果表明，肌红蛋白存在于第二个峰中.收集第二峰，走DEAE -52离子交换柱，并收集不同峰值的蛋白组分，电泳结果表明，经离子交换后获得了纯的肌红蛋白(见图2).
2.1.2 盐析、Sephacryl HR100柱层析及DEAE -52柱层析
粗提液用80%的硫酸铵盐析沉淀后，离心去上清，对沉淀进行透析，并取样进行电泳，结果见图2.
2.1.3 SDS -PA GE 电泳
将粗提的样品、经硫酸铵处理的样品、经Sephacryl HR100柱层析的样品、经DEAE -52离子交换柱层析的样品进行电泳实验，结果见图2.
511第2期马玉芹，等：心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究
从图2可知，粗提液中蛋白的种类较多(2泳道)，蛋白之间不能很好分辨清楚；盐析样品中蛋白的种类有所减少(泳道3)，电泳图谱较清楚;Sephacryl HR100凝胶样品中蛋白只剩两种(泳道4，样品未浓缩)；经DEAE -52离子交换柱层析后的样品只留下一条带，表明已经纯化得到一种蛋白，且相对分子质量约为17800.
1标准蛋白;2粗提液;3硫酸铵处理后样品;4Sephacryl HR100柱层析后样品(未浓缩);5,6,7DEAE -52柱层析后样品.图2 Sephacryl HR 100柱层析与DEAE -52柱层析电泳结果2.1.4 Ph.D -7噬菌体展示肽库筛选
利用Ph.D -7噬菌体展示肽库对心肌蛋白的特异性
亲和配体进行了三轮筛选，前两轮为非特异性筛选，第三轮
为特异性筛选，结果如下:
(1)第一轮洗脱物滴度为6.5×103个/μL ，收率为
3.74×10-6;
(2)第二轮洗脱物滴度为1.21×105个/μL ，收率为
6.96×10-5;
(3)第三轮洗脱物滴度为3.7×106个/μL ，收率为
2.03×10-
3.
对第三轮洗脱物挑斑测序，得其特异性亲和配体序列
为:Arg -His -Pro -His -Leu -Val -Ser.
2.2 讨论
肌红蛋白的相对分子质量约为17800，等电点为6.9.
根据其两性蛋白质性质，本实验主要采取了盐析、凝胶层析
与离子交换层析三种分离纯化方法.其中盐析法的采用非
常必要，粗提液经80%硫酸铵沉淀后，绝大部分杂蛋白会
变性，但肌红蛋白的活力没有受到影响.经过此步，部分杂
蛋白被除去，样液体积也大大减少，便于后续操作.凝胶层
析法主要是根据凝胶的分子筛效应，将相对分子质量大小不同的蛋白质相分离，本实验采用的Sephacryl HR100柱料理化性质稳定，且分离效率很高.实验结果表明，采用此柱料分离肌红蛋白效果较好.根据肌红蛋白表面的电荷效应，本实验采用DEAE -52离子交换柱料对其进行进一步纯化，离子交换后的电泳结果表明，利用DEAE -52纯化肌红蛋白是理想的，获得了肌红蛋白纯品.
本文利用噬菌体展示肽库技术，以纯化的心肌蛋白为靶分子筛选其特异性亲和配体，三轮收率逐渐提高，第三轮洗脱物测序结果专一性较强，说明利用七肽库筛选结果较理想.
3 结论
肌红蛋白是第一个被确定的具有三级结构的蛋白质，主要生物学功能是结合氧[5]，是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质.正常人的血液中肌红蛋白含量很少，当心肌或骨骼肌有损伤时，肌红蛋白便释放入血液
中，使血中肌红蛋白明显增高，故肌红蛋白是用于心肌损伤检测的标志物[6].其对急性心肌梗死的检测具有重要的诊断意义.
本实验主要是通过Sephacryl HR100凝胶层析和DEAE -52离子交换层析对匀浆、离心后的猪心进行分离纯化，每步纯化都经过SDS -PA GE 分析，结果证明，经过一系列分离纯化步骤可以得到电泳纯的肌红蛋白.
噬菌体展示是一种体外筛选技术.噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘选(panning )的体外选择程序得以快速鉴定[7].本文以分离纯化的心肌蛋白为靶分子，利用噬菌体展示随机肽库进行了三轮筛选，最终获得专一性较强的亲和配体，这为心肌蛋白试剂盒的临床研制与应用提供了可能.
611东北师大学报(自然科学版)第38卷
[参 考 文 献]
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The study on purif ication and aff inity ligand of myoglobin —a ne w
maker for detection of AMI
MA Yu 2qin 1,ZHAN G Shu 2hua 2,FAN Li 2ying 2,DON G Long 3,Q IAN Hai 2gang 2,Q IU Yu 2min 2
(1.College of Material and Chemical Engineering ,Changchun University of Science and Technology ,Changchun 130022,China ;
2.School of Life Sciences ,Changchun University of Science and Technology ,Changchun 130022,China ;
3.College of Environment and Resources ,Jilin University ,Changchun 130021,China )
Abstract :Myoglobin is composed of a heme prosthetic group and a polypeptide chain (globin )which have 152residues.Myoglobin exists mainly in myocardium ,cardiac muscle and the skeletal muscle.Myoglobin can store and assign the oxygen to all over the cell and tissue of the creature.It is proved recently that myo 2globin can be used as a good biological marker for detection of acute myocardial infarction (AM I ).In this thesis ,obtained myoglobin from bovine heart muscle using Sephacryl HR100filtration chromatography and DEAE -Sephacel ion -exchange chromatography.Aft
er SDS -PA GE get the pure product.Myoglobin is a sensitive maker which can be used in diagnosis of the sudden death from myocardial ischemia.The specific sequence of affinity ligand was obtained with the Ph.D -7phage display peptide library kit.The results make it possible for clinical development and application of the kit.
K eyw ords :myoglobin ;HR100;purification ;peptide library selection
(责任编辑：方 林)7
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