蔡浩原
【摘 要】In this paper, major developments in Surface Plasmon Microscope (SPM) technology are reviewed. Theory, experiment setup and application examples are presented .Two SPM technology trends, i.e., enhan-cing lateral resolution close to optical diffraction limit and combining with electrochemical /mechanical micro/nano manipulation methods , are suggested and discussed .%本文对表面等离子体显微镜的原理、架构和应用进行了综述，指出表面等离子体显微镜技术的未来发展方向是着力提高横向分辨率，接近光学衍射极限，以及发展与电化学、力学等微纳操纵手段结合的表面等离子体显微镜，形成微纳尺度下显微成像和操纵的闭环测量路径。 【期刊名称】《中国光学》
【年(卷),期】2014(000)005
【总页数】10页(P691-700)
【关键词】表面等离子体显微镜;细胞粘附;免标记;生物传感器;表面等离子体图像
【作 者】蔡浩原
【作者单位】中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室，北京100190
【正文语种】中 文
【中图分类】TP394.1;TH691.9
表面等离子体（Surface Plasmons,SP）是金属表面的自由电子非均匀分布的一种表现。自由电子在金属表面形成正、负电荷的密度分布,在这些正、负电荷的密度分布中,就形成了一种沿金属表面传播的电磁波,被称为表面等离子体波（Surface Plasmon Wave,SPW）。SPW一方面沿金属表面传播,另一方面以指数衰减的形式,穿透金属表面的介质约数百纳米,因此,它对金属表面的折射率变化非常敏感,理论上能达到10-7折射率单位（Refractive Index Unit,RIU）［1］。
当符合一定条件的入射光与SPW发生强烈耦合时,大部分的入射光能量被SPW吸收,转化为twamp
热量,此时金属表面的反射光变得很弱,这种现象被称为表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）。SPR生物传感器通过测量SPR条件的变化,可以检测发生在金属表面的生物分子相互作用,具有免标记、高灵敏度和实时响应的特点。基于SPR原理的生物传感技术已经被广泛的应用于免疫、食品、环境和纳米材料等多个研究领域［2-3］。
表面等离子体显微镜（Surface Plasmon Microscopy,SPM）是一种能够获取微观的表面等离子体共振图像的光学显微装置。它综合了表面等离子体传感器的高灵敏度和显微镜的高分辨率的优点,是研究细胞行为特性和纳米材料界面的尖端工具。早期的SPM是基于经典的Kretschmann结构,在出射端加装显微光路实现的［4-5］。基于类似的光学架构,Giebel搭建了一套用于观察活细胞/基质界面的SPM,验证了利用SPM获取单细胞SPR图像的可行性,并首次利用该装置获得细胞片足区与基底之间的距离（（25±10）nm）［6］。然而,基于棱镜架构的SPM的横向分辨率较低,上述系统约为12μm,远远大于光学显微镜的分辨率（约200 nm）。
造成棱镜架构SPM的横向分辨率较差的原因主要有：（1）要获得高分辨率,需要使用大数值孔径（Numerical Aperture,NA）的显微物镜,然而, NA越大,物镜镜头距离被测样品的距 离越短,而棱镜的物理尺寸限制了采用大NA显微物镜；（2）当光入射角度发生变化时,被照射的区域也在发生移动,棱镜结构无法将光路固定在一个微小的区域内；（3）SPW在金属表面的传播,会引起相邻两个点的SPR图像的互相干扰。SPW的波长直接决定了SPM横向分辨率的高低。
近年来,越来越多的科研人员尝试利用SPM技术去开展表面科学的研究,例如细胞在功能性表面的粘附特性,纳米颗粒在不同性质表面的动力学过程等。与原子力显微镜（AFM）,荧光显微镜等技术相比,SPM技术的最引人注目之处在于它可以免标记地研究界面之间的相互作用。然而,横向分辨率是SPM技术在科研中发挥更大作用的一个瓶颈,如何使SPM也能接近传统光学显微镜的分辨能力,是一个非常关键的技术问题。近年来,这一瓶颈已经通过各种技术手段得到解决,SPM的横向分辨率已接近光学显微镜的衍射极限（约200 nm）［7］。基于高分辨率SPM的高水平研究成果被陆续发表［8-15］。
本文将对SPM技术的发展进行综述。首先介绍SPM的工作原理、技术瓶颈和主要的光学架构,然后着重介绍近年来开展的一些应用实验成果,最后讨论SPM技术的未来发展方向。
为了更好地理解SPM技术,首先介绍SPM成像的物理学原理。如前所述,SPR现象发生在金
属和介质的界面上,由于SPW的传播波矢ksp大于入射光在真空中的波矢kin,因此,必须要借助棱镜耦合才能满足SPR的共振条件（图1）：
式中：kx是入射光波矢kin在X方向上的投影。
由式（1）可知,为满足共振条件,可以通过改变入射光的角度θ或者波长λ。当满足共振条件时,反射光强会出现一个最小值,对应的入射角度或波长被称为共振角θspr或共振波长λspr。
李忠仁
2.1 SPW的传播长度
如图1所示,SPW会沿着X方向在金属表面
传播,SPR图像的横向分辨率与SPW的传播长度直接相关。设想在金属表面的两个相邻的微粒,他们的距离为L,当L小于SPW的传播长度PL时,微粒1对SPW的扰动会波及微粒2（图2）。这就是SPW传播长度决定SPR图像横向分辨率的原因。
SPW可以用以下方程描述：
坦克巷战SPW沿着X方向传播,波矢为kx,在Z方向上,它的振幅按指数衰减。根据Maxwell方程,波矢kx
可以表示为：
式中：εm是金属的介电常数,εd是介质的介电常数。由于εm是一个复数,相应的,kx也可表达成为：
SPW在传播过程中,它的强度按照e-2kxix指数衰减,SPW的传播长度（PL）定义为强度衰减到1/e时的距离：
对于波长为650 nm的入射光而言,金（Au）和银（Ag）的传播长度分别为4.7μm和46.5μm。可以看出,为了达到高分辨率的SPM,例如达到1μm的水平,首先传播长度PL就必须要小于1μm。
2.2 显微物镜的数值孔径
高数值孔径（Numerical Aperture,NA）的显微物镜是高分辨率SPM图像的另一个重要条件,它决定了显微系统的细节分辨能力。在显微光学中,NA描述了物镜接收入射光线的锥形角：
单向阀式中,n代表物镜周围介质的折射率（例如,浸油物镜所使用的矿物油为1.52）,θ代表进入物镜的光线的最大锥形角的一半。对于光学系统而言,它的最佳分辨能力由下式定义：
因此,对于可见光光学显微镜,它的显微分辨能力约为200 nm。
2.3 棱镜型SPM的分辨能力瓶颈
自从Kretschmann提出棱镜耦合的SPR激发方式以来［16］,这一方法已经被广泛应用于SPR的仪器中。Homola.J对此进行了详细的综述［17］。基于棱镜的SPR仪器能够获得非常高的折射率分辨率（5×10-7RIU）。很自然的,研究者们会提出基于棱镜的SPM,并由Wolfgang Knoll最早实现［5］。
13vlib下面简单分析一下棱镜型SPM的工作原理（图3（a））。P偏振的光源被透镜准直后,经棱镜耦合照射在金属膜上,反射光在棱镜的另一侧出射,被显微光路收集,成像于CCD照相机上。为了满足SPR的条件,入射和出射光路一般对称的放置于棱镜两侧的扫描臂上,并根据需要,研究者们提出了各种角度扫描的机械方式［6,18］。Giebel等人搭建了一套棱镜型SPM系统,用于观察活细胞与基底的接触。为了方便对比,把同一区域的光学显微镜图像和S
PM图像放在一起进行对比（图3（b）,图3（c））。从图上可见,图3（c）显示的SPM图像在X方向上基本上不能分辨,其原因正是因为SPW的传播长度太长（约22μm,银,波长633 nm）。为了提高SPR图像的分辨率,利用具有较大吸收系数的铝作为金属膜的材料,获得了接近3μm的分辨率（图3（d））。
显然,这样的分辨率与光学显微镜的性能相比相差甚远。对于棱镜型SPM而言,主要的瓶颈在于：（1）棱镜的物理尺寸限制了高数值孔径显微物镜的采用；（2）由于采用的是斜入射方式,图像会发生变形。要提高SPM的图像分辨率,需要从以下3个方面着手：（1）缩短SPW的传播长度；（2）采用高数值孔径显微物镜；（3）满足SPR的激发条件。近年来,已经出现了数种高分辨率SPM的架构,下面对这些不同的架构进行介绍和讨论。
对高分辨率SPM而言,它应该能够满足SPR的激发条件的同时,达到或者接近传统光学显微镜的分辨率。一个典型的高分辨率SPM架构如图4所示。它通常采用倒置式显微镜的结构,并采用高数值孔径的显微物镜。准直后的P偏振光经过分束器入射到物镜中,随后被聚焦到金属膜上,相应的,反射光被物镜收集,经过分束器后,成像在CCD相机上。
由于棱镜型SPM很难应用高数值孔径的显微物镜,Kano等人首次实现直接利用浸油物镜激
发SPR［19］。折射率为1.51的匹配油介质扮演了与棱镜类似的波矢增强角。由于物镜的聚焦作用,聚焦到金属膜上的入射光角度范围从0°至80°,涵括了水溶液（n=1.33）的SPR共振角度,从而实现了SPR现象的激发。因此,物镜数值孔径对SPM的分辨率限制被克服,这种形式的SPM被称为显微物镜型SPM。
根据成像光路的不同,显微物镜型SPM可以分为两种类型：（1）宽场照明SPM和（2）扫描型SPM。对于宽场照明SPM而言,大约几十乘几十微米的区域被入射光均匀照明,反射光被物镜收集后,直接成像于CCD相机；而对于扫描型SPM而言,高轴对称性的入射光被物镜会聚到金属膜上,并在金属膜表面形成一个约200 nm的SPR局域电场。这一局域电场大大减少了SPW传播长度对SPR成像分辨率的影响,从而使得SPM达到传统光学显微镜的高分辨率成为可能。CCD相机捕捉每一点的FFT图像,并演算出该点对应的折射率。因此,扫描型SPM必须要通过一个XY扫描机制来获得高分辨率的SPR图像。
3.1 宽场照明SPM
宽场照明SPM（Wide-field SPM,WSPM）均匀地照亮成像区域,具有成像速度快,光路结构简单的优点。按照照明光路的不同,又可细分为两种类型。第一种为斜入射型WSPM（图5
（a））。入射光首先被聚焦到显微物镜的后焦平面上,经过物镜的整形后,以平行光的形式斜入射到金属膜的表面,被反射后,对称的从另一侧被物镜接收,并成像于CCD相机上［20］。由此看出,物镜和匹配液在这里取代棱镜的耦合作用,然而,SPW的传播长度仍然对SPR图像分辨率有决定性的影响。
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