由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。 1 沉淀法
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度
的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴ 中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶ 选择沉淀（热变沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变的杂蛋白。
⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
1.1 中盐沉淀（盐析法）
在溶液中加入中盐使生物大分子沉淀析出的过程称为"盐析"。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活物质具有稳定作用。袖袖阀管
糖化酶⑴ 中盐沉淀蛋白质的基本原理
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中盐的亲水大于蛋白质和酶分子的亲水，所以加入大量中盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页"图2－1"所示。
⑵ 中盐的选择
常用的中盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
① 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，（NH4）2SO4在0℃时仍有70.6％的溶解度，远远高于其它盐类：
表2－1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃
20℃
80℃
100 ℃
（NH4）2SO4
70.6
75.4
95.3
103态度纪录片
Na2SO4
4.9
18.9
43.3
42.2
NaH2PO4
1.6
7.8
93.8
101
② 分离效果好：有滇取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
③ 不易引起变，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L的（NH4）2SO4保存可达数年之久。
④ 价格便宜，废液不污染环境。
⑶ 盐析的操作方法
最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成 不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。
东海小哨兵 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，有人经过精心测量，确定出1升纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。
⑷ 盐析曲线的制作
如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：
取已定量测定蛋白质或酶的活与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始
出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。
⑸盐析的影响因素
① 蛋白质的浓度：中盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25 mg/mL～30mg/mL。
② pH值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶
解度小，因此用中盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。
③ 温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。
1.2 有机溶剂沉淀法
⑴基本原理
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极与其介电常数密切相关，极越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相
互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异电荷库仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
有机溶剂沉淀法的优点是：①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活的大分子容易引起变失活，操作需在低温下进行。十四大报告
⑵ 有机溶剂的选择和浓度的计算
用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。
进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：
V = V0 (S2 －S1) ／(100－S2)
式中：
V = 需加入100％浓度有机溶剂靛积
V0 = 原溶液体积
S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度
S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度
100是指加入的有机溶剂浓度为100％，如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式的(100－S2) 项应改为 (95－S2) 。
上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
⑶ 有机溶剂沉淀的影响因素
① 温度： 多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活越高。
②样品浓度：样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活的样品易产生稀释变。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常，使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。
③ pH值：有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。
④ 离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例，盐
浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜，少量的中盐对蛋白质变有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。
张庭玉
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