第十六章 实验技术
一、实验目的
1．了解糖类某些颜反应的原理。
2．学习应用糖的颜反应鉴别糖类的方法。
二、实验原理
1.α-萘酚反应（Molisch反应）原理
糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与α-萘酚生成紫红物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。
2.间苯二酚反应（Seliwanoff反应）原理
在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。
三、器材
1.试管及试管架 2.滴管
3.水浴锅
1.莫氏（Molisch）试剂： 5% α-萘酚的酒精溶液，称取α-萘酚5g，溶于95%酒精中，并用此酒精使总体积达100mL，贮于棕瓶内。此试剂需新鲜配制。 2.塞氏（Seliwanoff）试剂：称取间苯二酚0.05g溶于30 mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 mL，此试剂需新鲜配制。
3.1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
4.1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
5.1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
6.1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉1g与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。
7.0.1%糠醛溶液：称取糠醛0.1g，溶于100mL蒸馏水中。
8.浓硫酸 500mL
五、操作
1.α-萘酚反应（Molisch反应）
取5支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、0.1%糠醛溶液各1.5mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。斜执试管，沿管壁慢
慢加入浓硫酸约1mL，慢慢立起试管，切勿摇动。浓硫酸在试液下形成两层。在二液分界处有紫红环出现。观察、记录各管颜。
试剂 | 现象 | 解释现象 |
联芳楼1%葡萄糖溶液 | | |
1%果糖溶液 | | |
1%蔗糖溶液 | | |
1%淀粉溶液 | | |
0.1%糠醛溶液 | | |
| | |
2.间苯二酚反应（Seliwanoff反应）
取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液各5mL。再向各管分别加入塞氏试剂2mL，混匀。将3支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜的变化及变化时间。
六、思考题
1．可用何种颜反应鉴别酮糖的存在？
2．α-萘酚反应的原理是什么？
实验二 糖类的还原作用
一、实验目的
学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。
二、实验原理
许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，故在碱性溶液中能将铜、铋、汞、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。
本实验进行糖类的还原作用所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是含Cu2+的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红或黄的Cu2O沉淀。生成Cu2O沉淀的颜之所以不同是由于在不同条件下产生的沉淀颗粒大小不同引起的，颗粒越小呈黄，越
大则呈红。如有保护性胶体存在时，常生成黄沉淀。
三、器材
1．试管及试管架
2．竹试管夹
3．水浴锅
4．电炉
四、试剂
1．斐林（Fehling）试剂
菲林甲液（硫酸酮溶液）：称取34.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于500mL蒸馏水中。
菲林乙液（碱性酒石酸盐溶液）：称取125g氢氧化钠和137g洒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水中。
为了避免变质，甲、乙二液分开保存。用前，将甲、乙二液等量混合即可。
2．本尼迪克特（Benedict）试剂
初次分配和再分配
称取柠檬酸钠173g及碳酸钠（Na2建筑施工高处作业安全技术规范CO3·H2O）100 g加入600mL蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释至850mL。
另称取17.3g硫酸铜溶解于100 mL热蒸馏水中，冷却，稀释至150mL。
最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。
3．1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
4．1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
5．1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
6．1%麦芽糖溶液：称取麦芽糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
7．1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉1g与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。
五、操作
先取1支试管加入斐林试剂约 1mL，再加入4 mL蒸馏水，加热煮沸，如有沉淀生成，说明此试剂已不能使用。经检验，试剂合格后，再进行下述实验。
取5支试管，分别加入菲林甲、乙液各1 mL，再向各试管分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％麦芽糖溶液、1％淀粉溶液各1mL。置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却。观察各管溶液的变化。
另取6支试管，用本尼迪克特试剂（每管加2mL）重复上述实验。
比较两种方法的结果。
斐林氏与本尼迪克特试法：
溶液 现象 试剂 | 1%葡萄糖溶液 | 1%果糖溶液 | 1%蔗糖溶液 | 1%麦芽糖溶液 | 1%淀粉溶液 |
斐林氏试剂 | | | | | |
本尼迪克试剂 | | | | | |
| | | | | |
试解释以上表格现象：
六、思考题
1．斐林氏、本尼迪克特试剂法检验糖的原理是什么？
2．你熟悉的糖中那些具有还原性？
一、实验目的
熟悉一些常见蛋白质的颜反应
二、实验原理
蛋白质分子中的某些基团与显剂作用，可产生特定的颜反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜反应亦不同。颜反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜反应，因此不能仅根据颜反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。重要的颜反应有：
1.双缩脲反应
将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜在540nm 处比，定量测定蛋白质。
2.蛋白质的黄反应
黄反应是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和氨酸的蛋白质所特有的呈反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白沉淀，加热则白沉淀变成黄，再加碱颜加深呈橙黄，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄。
3.米伦氏反应
米伦试剂为、亚、硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白沉淀，加热后沉淀变成红。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。
4.茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应
三、器材
试管和试管架、滴管、水浴锅、酒精灯或电炉、量筒、滤纸片、烘箱、白明胶。
四、试剂
1. 卵清蛋白液：将鸡(鸭)蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。
2. 0.5%苯酚溶液：苯酚0.5mL，加蒸馏水稀释至100mL。
3. 1%白明胶液：1g 白明胶溶于少量热水，完全溶解后，稀释至100mL。
4. 米伦(Millon)试剂：40g 汞溶于60mL 浓硝酸(比重1.42)，水浴加温助溶，溶解后加2倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可长期保存。
5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。
6.浓硝酸：比重1.42。
7. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水中，稀释至100mL。
8. 尿素：如颗粒较粗，最好研磨成粉末状。
9. 10%氢氧化钠溶液：氢氧化难10g西村工人体育场溶于蒸馏水，稀释至100mL。
五、操作方法
1.双缩脲反应
①取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红石蕊试纸试之。至试管内有白固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH 溶液1mL 混匀，观察有无紫出现。
②另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰。
注意事项：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝的络离子Cu(NH3胶木轴瓦)42+，妨碍此颜反应的观察。
2.蛋白质的黄反应
在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶液5滴，观察颜反应。
3.米伦氏反应
① 用苯酚做实验：取0.5%苯酚溶液1mL 于试管中，加米伦试剂约0.5mL(米伦试剂含有硝酸，如加入量过多，能使蛋白质呈黄，加入量不超过试液体积的1/5～1/4)，小心加热，溶液即出现玫瑰红。
② 用蛋白质溶液做实验：取2mL 蛋白质溶液，加0.5mL 米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀(因试剂含汞盐及硝酸之故)，小心加热，凝固之蛋白质出现红。
注意事项：蛋白质溶液中如含有大量无机盐，可与汞产生沉淀从而丧失试剂的作用，如此试剂不能测定尿中的蛋白质。另外试液中还不能含有H2O2、醇或碱，因它们能使试剂中的汞变成沉淀。遇碱必须先中和，但不能用盐酸中和。
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