南瓜的力量束婷婷;井昶雯;吕志刚;解雨春;许家仁
【摘 要】目的 建立检测肿瘤慢性贫血患者铁调素(hepcidin) mRNA表达水平的荧光定量PCR法,初步观察肿瘤慢性贫血患者淋巴细胞铁调素mRNA水平.方法 建立荧光定量PCR检测铁调素mRNA的标准曲线,评价其灵敏度、特异性及重复性;检测50例体检健康者、49例肿瘤慢性贫血患者外周血淋巴细胞铁调素mRNA水平,同时检测血清白细胞介素6(IL-6)及血清铁(SI)水平.结果 荧光定量PCR检测铁调素mRNA的灵敏度为10 copies/μL,线性范围为101～107 copies/μL;熔解曲线示扩增峰单一;检测3份低、中、高浓度的阳性质粒批内CV分别为1.83％、1.27％、1.39％,批间CV分别为6.13％、7.48％、6.87％.肿瘤慢性贫血组铁调素mRNA水平为[10.51(8.02～ 16.31)]×10-3 copies/cell,高于健康人对照组[2.57(2.20～3.20)]×10-3 copies/cell,P＜0.01;外周血铁调素mRNA水平与IL-6水平呈正相关(r=0.92,P＜0.01),与SI呈负相关(r=-0.83,P＜0.01).结论 建立了定量检测外周血淋巴细胞铁调素mRNA的荧光定量PCR法,肿瘤慢性贫血患者铁调素mRNA水平高于健康人,可能与炎症反应有关. 【期刊名称】《临床检验杂志》
acrobat5【年(卷),期】u20战场2014(032)004
【总页数】3页(P249-251)让优秀传统文化活起来传下去
【关键词】肿瘤慢性贫血;铁调素;荧光定量PCR
【作 者】束婷婷;井昶雯;吕志刚;解雨春;许家仁
【作者单位】江苏省省级机关医院中心实验室,南京210024;江苏省肿瘤医院临床肿瘤实验中心,南京210009;江苏省省级机关医院中心实验室,南京210024;江苏省省级机关医院中心实验室,南京210024;江苏省省级机关医院血液肿瘤科,南京210024
【正文语种】中 文
苍蝇一分钟的生命
【中图分类】R446一幅壮锦的故事
慢性病贫血(anemia of chronic disease，ACD)是一种以介导免疫或炎症反应的细胞因子增多为特征的贫血，常见病因有慢性感染、各类炎症反应性疾病、肿瘤等[1]。Krause等[2]和Park等[3]先后从人血清和尿液中提纯了一个全新的小分子多肽——铁调素(hepcidin)。细胞
、动物实验表明，肿瘤引起的高炎症反应可诱导铁调素高表达，破坏铁代谢平衡，导致ACD的发生[4]。铁调素还可作为标志物鉴别诊断临床较难分辨的肿瘤缺铁性贫血及肿瘤慢性贫血，对两种贫血的对症具有指导意义[5]。目前血清铁调素水平的检测方法主要有ELISA法[6]及质谱法[7]。本研究用荧光定量PCR法检测肿瘤慢性贫血患者外周血淋巴细胞铁调素mRNA水平。
1.1 研究对象 按《血液病诊断及疗效标准》[8]选择2013年2～10月江苏省肿瘤医院就诊的肿瘤慢性贫血患者49例，男23例，女26例，年龄27～77岁，中位年龄48.0岁。包括胃癌11例、结肠癌10例、前列腺癌3例、乳腺癌6例、肺癌11例、宫颈癌4例、卵巢癌4例。男Hb<120 g/L，女Hb<110 g/L，呈正细胞或小细胞性贫血，骨髓涂片普鲁士蓝铁染显示细胞内铁阴性而细胞外可见蓝铁颗粒。所有患者均为新入院且未接受过放、化疗。血液肿瘤患者涉及骨髓造血功能异常者予以排除。选择同期体检健康者50例作为健康人对照组，男24例，女26例，年龄29～87岁，中位年龄51.5岁。2组间年龄、性别差异均无统计学意义(P均>0.05)。
1.2 主要试剂与仪器 Trizol(Invitrogen公司)；RevertAid逆转录试剂盒(Thermo公司)；淋巴
细胞分离液(瀚洋公司)；SYBR(Invitrogen公司)；琼脂糖凝胶回收试剂盒，EcoRⅠ内切酶、HindⅢ内切酶、T4连接酶、DL 2000 DNA marker、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、质粒提取试剂盒(TaKaRa公司)；人胚肾细胞系293T、大肠埃希菌DH5α(本实验室保存)；PTC-100 PCR仪(MJ Research公司)；Light Cycle 3.0荧光定量PCR仪(Roche公司)；AlphaImager HP 荧光可见光凝胶成像系统(Cell Biosciences公司)；超微量核酸蛋白测定仪(Quawell公司)。
1.3 标本采集与处理 分别采集研究对象初诊时空腹静脉血2、5 mL，2 mL用EDTA-K2抗凝并混匀，用Beckman LH 750血液分析仪检测淋巴细胞数，同时吸取1 mL用密度梯度离心法分离淋巴细胞，收集于无RNA酶的EP管中，按Trizol说明书提取总RNA，用RevertAid逆转录试剂盒逆转录cDNA。5 mL以3 000 r/min离心5 min分离血清，分4等份分装于1.5 mL EP管中，-80 ℃保存，送迪安公司检测白细胞介素6(IL-6)和血清铁(SI)。
1.4 引物设计 参考文献[9]铁调素引物序列，并经GenBank比对确认，上游引物(5′→3′)：CCTGAC
CAGTGGCTCTGTTT，下游引物(5′→3′)：CACATCC
CACACTTTGATCG，产物长度183 bp。铁调素PCR标准曲线质粒构建引物根据GenBank已知基因序列号(NC_000019.10)，取序列上、下游各23个碱基，根据载体多克隆位点分布，上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入EcoRⅠ酶切位点(下划线部分表示酶切位点)。上游引物(5′→3′)：CCAAGCTTATG
CCTGACCAGTGGCTCTGTTT，下游引物(5′→3′)：CG
GAATTCCTACACATCCCACACTTTGATCG，产物长度205 bp。所有引物均由上海英潍捷基公司合成。
1.5 铁调素重组质粒的构建及标准曲线的建立 Trizol法提取293T细胞RNA，取1 μg RNA逆转录为cDNA，以此cDNA为模板扩增。PCR反应体系为50 μL：5×PrimeStar buffer 10 μL，dNTP Mixtrue(2.5 mmol/L)4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板cDNA 1 μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，灭菌蒸馏水补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 预变性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，以Hind Ⅲ，EcoRⅠ两个酶切位点连接入pCDNA 3.1(+)载体，转化DH5α感受态细胞，37 ℃培养12 h，筛选阳性克隆。扩增质粒经
测序鉴定完全正确后，测定质粒拷贝数，计算公式为质粒拷贝数(copies/μL)=质粒浓度(ng/μL)×10-9×6.02×1023/660×双链DNA长度(bp)。将重组质粒分别稀释为100～108 copies/μL，荧光定量PCR测定标准曲线。
1.6 荧光定量PCR 总反应体系：2×SYBR 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA或标准质粒1 μL，去离子水补足至20 μL。循环参数：50 ℃ 2 min；95 ℃预变性 2 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，采集荧光信号，共40个循环。熔解曲线参数：95 ℃ 5 min；70 ℃ 1 min，每个标本做平行复孔3个。铁调素mRNA定量结果用铁调素mRNA拷贝数与外周血淋巴细胞数的比值表示。
1.7 统计学分析 用SPSS 20.0软件进行。检验计量资料是否满足正态分布；正态分布的资料用表示，两组间比较用两独立样本的t检验；偏态分布资料用M(P25～P75)表示，两组间比较用Mann-Whitney U检验；铁调素与IL-6、SI的相关性用Spearman相关分析。以P<0.05为有统计学意义。
2.1 铁调素重组质粒的鉴定 随机挑选3个重组质粒克隆进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示3个克隆均包含目的片段，见图1A。选择2个克隆进行酶切，一条产物在5 500 bp附近(载
体)，一条为205 bp(插入序列)，见图1B。选取1号克隆测序，结果用DNA MAN软件与GenBank序列比对，显示插入序列正确、无突变，见图1C。
2.2 荧光定量PCR标准曲线建立及方法学评价 将铁调素重组质粒稀释为100～108 copies/μL，荧光定量PCR检测线性范围在101～107 copies/μL，灵敏度为10 copies/μL。熔解曲线显示，所有被测标本在87 ℃均有单一的特异性的主扩增峰，而阴性对照无任何扩增峰。稀释3份不同浓度(107、105、103 copies/μL)的阳性质粒标本进行荧光定量PCR，每份标本做5个平行管，每隔1 d进行扩增，连续6 d，循环阈值(Ct)的批内CV分别为1.83%、1.27%、1.39%；批间CV分别为6.13%、7.48%、6.87%。
2.3 铁调素、IL-6、SI检测结果 肿瘤慢性贫血组铁调素mRNA水平为[10.51(8.02～16.31)]×10-3 copies/cell、IL-6为12.50(8.85～19.60)pg/mL，高于健康人对照组[2.57(2.20～3.20)]×10-3 copies/cell、1.70(1.30～2.52)pg/mL(Z=8.57、8.56，P均<0.01)；肿瘤慢性贫血组SI水平为13.40(8.70～15.35)μmol/L，低于健康人对照组22.80(20.02～27.75)μmol/L(Z=-7.88，P<0.01)。49例肿瘤慢性贫血患者铁调素mRNA水平与IL-6呈正相关(r=0.92，P<0.01)，与SI呈负相关(r=-0.83，P<0.01)。
铁调素作为有抗菌活性的小分子多肽，在铁代谢过程中具有重要调控作用，参与包括贫血、遗传性血病、慢性肾病在内的多种铁代谢失衡相关疾病的发生[10]。前期研究中我们分别用传统的内参基因和淋巴细胞数校正cDNA模板浓度，以内参基因做校正，肿瘤慢性贫血组与健康人对照组相比铁调素 mRNA升高了6.13倍，而用淋巴细胞数校正升高了5.88倍，升高的倍数间差异无统计学意义(P>0.05)，证明了用淋巴细胞数作为内参校正的可行性。
肿瘤激活的免疫-炎症系统释放多种炎症因子包括IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α等，其中IL-6的上调时间与铁调素升高时间最为吻合，IL-6可直接作用于肝细胞通过STAT3途径导致铁调素合成增加[10]。关于人外周血中IL-6水平和铁调素表达水平间缺乏相关的研究数据，前期研究多停留在细胞及动物实验水平。本研究表明肿瘤慢性贫血患者外周血淋巴细胞铁调素mRNA升高与外周血IL-6水平升高呈正相关，与SI水平呈负相关。推测铁调素表达升高可能导致体内铁大量储存于单核巨噬细胞系统，无法满足血红蛋白合成的需求，继而发生贫血。
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