韩宏岩;许维岸;桂江;贡成良
【摘 要】@@%分析了黄粉虫血淋巴诱导前后酪氨酸羟化酶(TH)的表达特性,用TH抑制剂3-碘-L-酪氨酸(3IL)抑制血淋巴TH活性,观察TH活性被抑制后血淋巴黑化过程的变化.结果显示,TH在黄粉虫血淋巴免疫诱导后开始表达,抑制TH的活性,血淋巴黑化反应减弱,表明TH在黄粉虫血淋巴黑化反应中起着一定作用. 【期刊名称】《江苏农业科学》
王夫人
【年(卷),期】蛆疗2012(040)008
【总页数】2页(P41-42)
【关键词】酪氨酸羟化酶;黄粉虫;血淋巴;黑化
【作 者】韩宏岩;许维岸;桂江;贡成良
【作者单位】苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州21523;苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州21523;苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州21523;苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州21523
【正文语种】中 文
【中图分类】Q55
在昆虫体内酪氨酸羟化形成多巴，多巴在一系列酶的作用下，转变成多巴醌、多巴胺等儿茶酚及儿茶酚胺类物质，随后多巴衍生物参与昆虫表皮硬化和黑化反应，多巴胺在神经传导中发挥重要作用。在形成儿茶酚衍生物的系列反应中，酪氨酸转化成多巴的第一步反应是限速反应，因此催化该反应的酶在昆虫生理发育中具有重要的作用。目前报道酪氨酸的羟化反应可以被两种类型的酶所催化，即酪氨酸羟化酶(TH)及酚氧化酶(PO)[1-2]。TH (E. C.1. 14. 16. 2) 又称酪氨酸3-单加氧酶，在四氢生物喋呤(tetrahydrobiopterin，BH4 )和Fe2+作辅因子条件下，催化酪氨酸氧化为多巴；PO (E.C. 1.14.18.1)具有酪氨酸3-单加氧酶和多酚氧化酶的活性，催化酪氨酸氧化成多巴，然后继续催化多巴的氧化反应。
定量风险分析TH在脊椎动物及无脊椎动物中是高度保守的。在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中，TH基因缺陷型可导致胚胎死亡[3]，突变研究表明TH与果蝇表皮鞣化及神经功能有关[4-5]。TH在烟草天蛾、赤拟谷盗表皮硬化和免疫相关的黑化中具有重要的功能[1，6]。昆虫体内PO以酶原的形式存在，尽管TH和PO都可以催化酪氨酸形成多巴，但是两者在昆虫体内的表达分布及其调控机制不同，催化反应条件也不同，目前还不清楚这两种酶在不同的代谢途径中是共同起作用还是单独起作用。本试验以鞘翅目昆虫黄粉虫(Tenebrio molitor)为研究对象，利用TH和PO的专一抑制剂，探讨了TH在黄粉虫血淋巴中的作用，以期为鞘翅目昆虫病虫害防治的研究提供参考。
1 材料与方法
国内域名1.1 材料与试剂
昆虫来源：黄粉虫购自苏州市花鸟市场，昆虫光照培养箱内自行饲养，以麦麸作饲料，上覆白菜叶片以提供水分。苯基硫脲(phenylthiourea，PTU)、3-碘-L-酪氨酸(3IL)、L-多巴(L-DOPA)均购自Sigma公司，SDS试剂购自上海生物工程股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 TH和PO活性的测定 TH活性的测定：以L-酪氨酸为底物，加入重组表达的黄粉虫酪氨酸羟化酶(苏州大学基础医学与生物科学学院实验室原有保存的大肠杆菌重组表达后纯化的TH)，用高效液相谱紫外检测法(HPLC-UV)检测L-多巴的生成量，外标法定量，通过反应产物L-多巴的量来确定TH的活性。TH活性的定义为：酶活性(U)=每分钟生成0.1 μg/mL的L-DOPA所需要的酶量。PO活性的测定：以L-酪氨酸为底物，反应液中加入10 μL PO血淋巴提取液和少量SDS激活剂，470nm波长下测定吸光度。PO活性的定义为：酶活性(U)=每分钟吸光度增加0.01所需要的酶量。
1.2.2 TH转录表达分析 随机选取发育一致的末龄成熟黄粉虫幼虫，微量注射器吸取5 μL悬浮于PBS的灭活大肠杆菌菌液，从黄粉虫腹部倒数第2体节注入，将注射后倒流严重的剔除，低熔点石蜡封住针孔，后放置于光照培养箱中正常培养。在注射3、6、9 h后解剖获得脑、血细胞，并提取总RNA，通过半定量RT-PCR方法进行定量，同时设置未注射菌液的空白对照组。
1.2.3 TH对血淋巴黑化反应的影响 黄粉虫的诱导方法同“1.2.2”，在注射6 h后取40 μL血淋巴，分别点在白的塑料板上，然后取10 μL不同浓度的TH抑制剂立即与血淋巴混合均匀，
三叔丁基膦观察血淋巴颜的变化，计时并拍照，以血淋巴中加生理盐水和加TYR抑制剂PTU为对照。
2 结果与分析
2.1 3IL对TH和PO的抑制特性
3IL虽然是TH的抑制剂，但是由于3IL也是PO底物类似物，因此首先试验3IL是否也抑制PO活性。由图可知，3IL在浓度大于1 mmol/L时，能明显抑制TH活性，而3IL浓度大于3mmol/L对PO活性开始有影响。因此，在3IL浓度小于3 mmol/L时，3IL不影响PO活性，因此本试验使用0.5～2.5 mmol/L 3IL作为专一性TH抑制剂，评价TH在血淋巴黑化中的功能是可行的。
2.2 TH在血淋巴组织的表达
分别取大肠杆菌诱导前后黄粉虫血细胞提取mRNA，进行半定量PCR检测TH的转录表达水平，结果显示如图2，头部TH诱导前后都有表达，相对于头部组织的表达，TH在没有诱导时血细胞中没有THmRNA，当大肠杆菌诱导后3 h开始有TH的表达。由此结果可推断，TH
与血淋巴免疫防御过程可能有关。
2.3 抑制剂处理对血淋巴黑化过程的影响
大肠杆菌诱导后，取黄粉虫血淋巴，几次冰箱冷冻片刻后室温融化，使血细胞裂解，向血淋巴中加入3IL或PTU，观察血淋巴黑化反应产生黑素的时间和血淋巴颜的变化，从而判断TH在血淋巴黑化反应中的作用。从图3可以看出，室温条件下，未加抑制剂或加入生理盐水的血淋巴在40 min时开始黑化(图中斑点0、0’)，血淋巴中加入抑制剂PTU后，随着抑制剂浓度的增加，黑化反应抑制能力逐渐增强，40 min时斑点1～2有少量黑化现象，斑点4、5仍然没有颜变化，直到100 min，斑点4、5开始黑化，此时的对照血淋巴斑点0、0’颜已经很深，黑化现象已经非常明显。加入TH抑制剂3IL的血淋巴斑点1’至5’，随着抑制剂浓度的增加，黑化现象减弱，60 min以后1.5、2.0、2.5 mmol/L的3IL斑点3’～5’颜变化明显比对照斑点0、0’浅，但是比PTU斑点3～5颜深。该试验结果说明，TH在血淋巴的黑化反应中具有一定的作用，TH对血淋巴黑化的作用可能比PO小。
3 结论与讨论
2006年高考试题本试验利用3IL抑制血淋巴TH的活性，观察到血淋巴的黑化现象明显减弱，表明TH不仅在神经组织中对多巴胺等神经递质的合成具有重要功能，在血淋巴响应免疫黑化过程中也具有一定的作用。酪氨酸羟化形成多巴的过程是整个黑化反应的限速步骤，因此TH或PO在黑化发生中起着决定性作用。从本试验现象观察，由于3IL抑制黑化的程度比PTU弱，推断TH在诱导后的血淋巴黑化中所起的作用可能比PO小。由于PO催化酪氨酸形成多巴的反应，有一个催化的滞后过程，而TH催化没有滞后期，因此当昆虫响应外界侵袭时，血淋巴凝集入侵的微生物，此时TH开始在血淋巴表达发挥作用，使酪氨酸快速转化成多巴，促进黑化反应的进行。由于昆虫TH组织表达量极低，很难从组织中提取TH研究其生理生化功能。本试验利用重组表达的TH，证实在试验浓度范围内3IL专一抑制TH活性，过高的3IL浓度也对PO产生抑制作用，所以3IL作为TH的专一性抑制剂使用，应该控制一定的浓度。TH在血淋巴中表达和促进黑化反应的功能研究可为理解鞘翅目昆虫TH的生理生化功能提供参考。
【相关文献】
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