10ml 人外周血血样(EDTA-2K抗凝管采集)
稀释血样:D’Hanks 以1:1稀释
加入淋巴细胞分离液(稀释血样:淋巴细胞分离液=2:1)
室温,2000rpm/min 离心20min
吸取单个核细胞层
D’Hanks洗涤细胞
1500 rpm/min 离心10min
D’Hanks洗涤细胞
1000 rpm/min 离心10min
收集淋巴细胞沉淀(细胞计数:约1×107个细胞)
2. 外周血淋巴细胞RNA提取:
1×10圣格7个淋巴细胞中加入1ml TriZol,4℃静置5min,裂解
加入200ul氯仿,上下颠倒至溶液出现浆白,无分相现象
置于冰上5min;4℃,12000rpm/min,离心15 min
将上层水相移入另一离心管,加等体积异丙醇,冰上孵育10min
4℃,12000rpm/min,离心10 min
弃上清,在沉淀(含RNA)中加1ml 75%乙醇洗涤
4℃,12000 rpm/min,离心5 min,得到RNA沉淀;空气干燥后,用适量TE或无RNase水溶解备用
土耳其式开局
RNA浓度:1400μg/μl狐狸之歌,OD260/OD280=2.00
淋巴细胞分离液:
上海华精生物高科技有限公司
标准号:Q/GHSB 85-2001 批号:040524
试剂 | 使用量 |
Oligo dT Primer (50μM) | 1μl |
dNTP Mixture (10mM each) | 1μl |
模板RNA | Total RNA:5μg以下(4μl) |
RNase Free dH2O | Up to 10μl |
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2. 65℃保温5min后,冰上迅速冷却。
3. 在上述Microtube中配制下列反转录反应液,总量为20μl。 试剂 | 使用量 |
ollier病是什么意思上述变性后反应液 | 10μl |
5×PrimerScriptⅡ Buffer | 4μl |
RNase Inhibitor (40U/μl) | 0.5μl (20U) |
PrimerScriptⅡ RTase (200U/μl) | 1μl (200U) |
RNase Free dH2O | Up to 20μl |
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4. 缓慢混匀。
5. 按下列条件进行反转录反应:42℃ 30-60min,95℃ 5min,冰上冷却。
以PET28a为载体表达产物N端带有可以被thrombin酶切的组氨酸标签,
上游primer:称呼后缀5’-GGAATTCCATATGACCTGCTGCAGTCTACAC -3’ (Nde I酶切位点以及保护碱基)
下游primer:5’-CCGCTCGAGTTAAAATTTTAATAGCTAGTCTTCG-3’(Xho I酶切位点以及终止密码子、保护碱基)