qq空间打开空白
作者：杨伟克 唐芬芬 刘增虎 董占鹏
男人体来源：《南方农业学报》2020年第10期
党的奋斗目标
波尔
摘要：【目的】研究外源昆虫激素对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响，明确昆虫激素对酚氧化酶的调控作用，为深入解析家蚕酚氧化酶的功能及基因表达调控机制提供参考依据。【方法】对五龄第3 d发育良好的家蚕幼虫注射蜕皮激素20E和保幼激素JH，以注射等量0.1%二甲基亚砜（DMSO）为对照，分别在注射3、6、12和24 h后解剖
家蚕幼虫采集血淋巴和体壁，检测分析家蚕酚氧化酶活性及其基因表达的变化情况。【结果】注射外源JH和20E均能促进家蚕血淋巴酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表达，有效增加酚氧化酶活性。家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因对JH和20E的响应时间存在一定差异，其中，经JH处理后2个酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）仅在处理6和12 h时显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）上调表达;而经20E处理后PPO1和PPO2基因从3 h开始一直持续到12 h均呈上调表达趋势。JH和20E对家蚕体壁PPO1和PPO2基因的影响恰好相反，具体表现为：JH能有效抑制家蚕体壁PPO1和PPO2基因的表达，降低酚氧化酶活性;20E则促进家蚕体壁PPO1基因上调表达，但不影响PPO2基因表达。【结论】家蚕酚氧化酶原基因PPO1和PPO2表达受JH和20E的调控，且激素对酚氧化酶原基因表达水平的影响与其酶活性变化规律一致，提示酚氧化酶不仅参与昆虫激素的代谢，还与激素协同调控家蚕的蜕皮变态。
关键词： 家蚕;昆虫激素;酚氧化酶;血淋巴;体壁;蜕皮变态
中图分类号： S883.89 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）10-2573-07天道酬勤不酬怨
Effects of insect hormone on activity of phenoloxidase and its gene expression inhe
molymph and integument of Bombyx mori
YANG Wei-ke1， TANG Fen-fen2， LIU Zeng-hu1， DONG Zhan-peng1*
（1Sericulture and Apiculture Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Mengzi， Yunnan 661101， China; 2College of Life Science and Technology， Honghe University， Mengzi， Yunnan 661101， China）
Abstract：【Objective】To clarify the regulation effect of insect hormones on phenoloxidase activity and gene expression of Bombyx mori， and study regulation effect of insect hormones on phenoloxidase， which could provide a theoretical reference for further research on the function of phenoloxidase and gene expression regulation mechanism. 【Method】Ecdysone 20E and juvenile hormone JH were injected into the silkworm at day 3 of 5th instar larva and the same amount of 0.1% dimethyl sulfoxide （DMSO） was injected as a control group. The phenoloxidase activity and gene expression level were determined in hemolymph and integument of silkworm at 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after injection. 【Result】The results showed that the expression of pr
ophenoloxidase genes PPO1 and PPO2 in hemolymph of silkworm were up regulated by 20E and JH， and the phenoloxidase activity was also higher than the control group. There was difference in response times of PPO1 and PPO2 in hemolymph of silkworm to 20E and JH. The expression of PPO1 and PPO2 were only significantly up-regulated at 6 h（P<0.05） and extremely up-regulated at 12 h（P<0.01） after JH treatment. While the expression of PPO1 and PPO2 were up-regulated from 3 h to 12 h after 20E treatment. The effects were opposite of JH and 20E on the expression of PPO1 and PPO2 in integument of silkworm. The expression of PPO1 and PPO2 were inhibited by JH and the phenoloxidase activity was decreased at the same time. 20E could induce the expression of PPO1，but did not affect the expression of PPO2 in integument of silkworm. 【Conclusion】The PPO1 and PPO2 expression in silkworm are regula-ted by JH and 20E. In addition， the effects of JH and 20E on the gene expression are consistent with the change rule of phenoloxidase activities. It is suggested that the phenoloxidase are involved in the metabolism of insect hormones and coordinately regulates the molting metamorphosis with JH and 20E in silkworm.
Key words： Bombyx mori; insect hormone; phenoloxidase; hemolymph; integument; molting metamorphosis
Foundation item： Modern Agricultural Sericulture Industrial Technology System Construction（Chief Scientist） Project of Yunnan（2019K-JTX006）; Applied Basic Research Project of Yunnan Academy of Agricultural Sciences（YJM 201710）瓶颈效应
0 引言
【研究意義】酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）是一类能将酚类氧化成邻苯醌或对苯醌的酶，广泛分布于动植物界，在生物体内发挥着极其重要的生理功能作用（陈晓宇等，2015;苑胜垒等，2016）。昆虫酚氧化酶通常以非活化状态的前体酚氧化酶原存在，主要分布在血淋巴和体壁等组织中（Yang et al.，2018）。酚氧化酶原通过酚氧化酶原激活系统转变为具有活性的酚氧化酶，参与调控昆虫的一系列生理过程，包括免疫防御、伤口愈合、表皮的鞣化和黑化等（Jearaphunt et al.，2014;Wu et al.，2017）。保幼激素和蜕皮激素是调控家蚕（Bombyx mori）生长发育与蜕皮变态的主要激素，研究家蚕酚氧化酶活性及其基因表达在外源激素处理后的变化规律，可为阐明激素对酚氧化酶基因的分子调控
机制提供理论依据。【前人研究进展】当昆虫机体遭受病原微生物、杀菌剂和杀虫剂等外源异物刺激时，其体内的酚氧化酶活性及基因表达水平均会受到一定程度的影响（杨伟克等，2019a）。杜育哲等（2002）以蜕皮激素类杀虫剂处理棉铃虫四龄幼虫6 h，结果发现血淋巴蜕皮激素滴度下降，幼虫蜕皮困难，酚氧化酶活性显著降低。金华超等（2013）研究表明，三唑酮、肟菌脂、咪鲜胺和申嗪霉素4种杀虫剂能有效激活赤眼蜂酚氧化酶活性，说明杀菌剂不仅对赤眼蜂产生毒害作用，在一定程度上还能激活其免疫应答反应。庞海玉等（2013）研究发现，以0.1和0.5 mg/L的20-羟基蜕皮甾酮（20E）处理异瓢虫，不影响其生理状态及酚氧化酶活性;但1.0、5.0和10.0 mg/L的20E均导致幼虫生长缓慢，死亡率增加，且过氧化物酶和酚氧化酶活性受到抑制。张道伟和陈静（2014）采用大肠杆菌刺激德国小蠊，结果发现其血淋巴和表皮中的酚氧化酶基因均显著上调表达，酚氧化酶活性也随着诱导时间的延长而逐渐增强。柴连琴等（2015）研究表明，20E不仅能提高棉铃虫血细胞的运动能力，还能通过激活血淋巴酚氧化酶活性，进而增强血细胞对外源微生物的吞噬能力。李一波等（2017）研究发现，喂食曲酸不仅能抑制飞蝗酚氧化酶活性，还会影响飞蝗的其他代谢酶活性。Zhang等（2018）研究表明，南亚寡鬃实蝇ZtPPO1基因在幼虫到蛹的变态过程中高效表达，但喂食曲酸能抑制蜕皮激素的合成，降低酚氧化酶活性，导
致化蛹蜕皮困难，暗示ZtPPO1基因表达及其酶活性受蜕皮激素20E调控。家蚕机体内存在2个酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2），其幼虫酚氧化酶活性变化具有明显的发育时期和组织特异性，且组织表达谱分析显示酚氧化酶原基因在血淋巴和体壁中均高效表达（毛钰霞等，2017）。唐芬芬等（2016）研究发现，喂食家蚕核型多角体病毒（BmNPV）能诱导家蚕血淋巴酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）上调表达，且酚氧化酶活性显著增加。杨伟克等（2019b）研究表明，经口添食大肠杆菌或金黄葡萄球菌均能诱导家蚕血淋巴酚氧化酶原基因上调表达及酶活性增加，说明酚氧化酶在家蚕抗病毒及抵御细菌等病原微生物的过程中发挥重要作用。此外，已有研究发现家蚕酚氧化酶原基因PPO1在蜕皮变态阶段呈上调表达，但在蜕皮结束后其表达量下降，即干涉PPO1基因表达可导致家蚕无法正常化蛹（Wang et al.，2013;Xu et al.，2015）。【本研究切入点】家蚕酚氧化酶原基因表达水平及其活性在四龄眠前期较高，眠中减弱，眠后期增强，说明酚氧化酶活性变化与昆虫激素水平存在一定相关性（杨伟克等，2019a），但至今有关昆虫激素对家蚕酚氧化酶活性影响及其基因表达调控的研究相对较少。【拟解决的关键问题】研究外源昆虫激素对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响，明确昆虫激素对酚氧化酶的调控作用，为深入解析家蚕酚氧化酶的功能及其基因表达调控机制提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试家蚕品种为大造，恒温培养箱26 ℃，相对湿度（75±5）%，光照周期（12 h光∶12 h暗），新鲜桑叶饲育。蜕皮激素20E（Y0002054）和保幼激素（JH）类似物（33375）购自Sigma公司，动物组织总RNA抽提试剂盒（ER501-01）购自北京全式金生物技术有限公司，反转录试剂盒（RR047A）购自TaKaRa公司，荧光定量试剂Hieff TM qPCR SYBR® Green Master Mix（11201ES03）购自上海翊圣生物科技有限公司，酚氧化酶测试盒（A136-1-1）购自南京建成生物工程研究所。
1. 2 激素处理及样品采集
激素处理操作参照Gui等（2006）的研究方法。选取家蚕五龄第3 d发育良好的幼虫，采用微量注射器在每头家蚕幼虫腹部分别注射2.0 μL保幼激素JH（0.5 μg/μL）和蜕皮激素20E（1.0 μg/μL），以注射等量0.1%二甲基亚砜（DMSO）为对照。分别在注射3、6、12和24 h后解剖家蚕幼虫，采集血淋巴和体壁，每次取样均设5次重复，每个重复取5头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。
1. 3 酚氧化酶活性测定
Key words： Bombyx mori; insect hormone; phenoloxidase; hemolymph; integument; molting metamorphosis
Foundation item： Modern Agricultural Sericulture Industrial Technology System Construction（Chief Scientist） Project of Yunnan（2019K-JTX006）; Applied Basic Research Project of Yunnan Academy of Agricultural Sciences（YJM 201710）
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议