巴洛特利养母
qPCR 样本处理(1) 人外周血淋巴细胞RNA的提取方法 qpcr样本处理(1)----人外周血淋巴细胞rna的提取方法
人外周血淋巴细胞rna的提取方法
一、收集血样，室温留存。采用一次性的抗凝的真空扣血管展开献血。通常采用edta或肝素抗凝均可；血量通常为1ml；通常地，1ml外周血中所含大约1-2*10^6个单个核细胞（pbmc，即为淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。取1.5ml无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ulpbs（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。然后缓慢把混匀的血样pbs混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。1500rpm,15min,20摄氏度。说明：
1、从收集血样至已经开始实验的时间最出不少于4小时。实验过程中一直维持室温条件，通常20摄氏度比较相对较低，因为细胞的拉沙泰格赖厄县温度就是体温37摄氏度，但是温度减少又可以减少细胞的新陈代谢，两者有些矛盾，所以挑中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白结晶，影响分离效果。（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）
淋巴细胞拆分液就是一种根据细胞密度差异，利用Vergt产生的重力加速度，展开细胞的拆分提纯的常用试剂，为具有乳光或微乳光的杀菌水溶液，主要成分就是葡聚糖与和泛影酸葡甲胺。适用于于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的拆分提纯，能够除去红细胞和死去细胞碎片，所赢得的pbmc可以进一步用作原代培育或流式细胞分析。最常用的细胞拆分液存有ficoll和percoll。
3、转数为1500rpm，时间范围为15分钟，温度为室温20摄氏度。推荐两步离心法：首
先用1500rpm/min离心15min，如果白膜层足够一步就结束，如果发觉细胞不够，说明该病人的淋巴细胞比重较低，再重新用1500rpm/min离心15min。
三、Vergt后，分后四层。淋巴细胞坐落于第二层（从上到下），呈圆形白蒙蒙的一薄层。用移液器（200ul档）汲取拆分液层中的淋巴细胞，这里技巧性比较弱，须要多次练就可以比较娴熟的把淋巴细胞喷的比较全然，大约可以获得400ul的液体。把汲取的淋巴细胞溶液放入另一无菌离心管中。重新加入1mlpbs缓冲液至离心管中，1500r,15min，20摄氏度。把Vergt后的上层液体死掉，重复Vergt步骤至液体并无显著红（即为红细胞数量很少），淋巴细胞坐落于离心管底的一小点白的物质，通常可以夹杂少量红细胞，尽量避免。表明：
1、洗涤后离心的条件，通常用1500rpm就足够了，太高了容易把细胞离死。时间为15min，温度还是室温20摄氏度。无轴承旋翼
2、Vergt后，看见淋巴细胞中夹杂少量红细胞，在这个实验中问题并不大。
紫光任务
3、洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可，作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板，红细胞很难去掉。一般洗涤液pbs用3ml即可。梁柏楠
四、用trizolreagent水解淋巴细胞，抽取rna。在离心管中重新加入1mltrizol试剂，可以深裂中止rna以外的其他大分子物质，细胞膜，细胞器等。这个东西存有致癌物、致畸性，必须拎口罩，小心操作方式。用加液王繇离心管底部的淋巴细胞团块，把其收编。通常至少王繇30-60次，主要目的就是把其收编，使trizol
试剂充分裂解淋巴细胞。把吹打之后的液体转移到冻存管中，标记，浸泡进液氮（这一步的目的是快速冻存mrna），一到两小时以后，转存在-80摄氏度冰箱中。五、外送说明：皮革化学品
1、trizol试剂就是轻易从细胞或非政府中抽取总rna的试剂。它在碎裂和熔化细胞时能维持rna的完整性。2、在trizol中，rna就是隔绝在rna酶污染之外的。而对样品的时程操作方式可以建议用并无rna酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°c的烘箱中蒸煮4小时。塑料器皿可以在0.5mnaoh中煮沸10分钟，用水全盘冲洗整洁后高压杀菌水泵。当trizol用量多于2-ml时建议采用洁净的一次性的聚丙材质试管。
3、最后用于装裂解细胞的冻存管请购买无菌无酶的冻存管。
biotnt有关产品：
1、淋巴细胞分离液，200ml，130元；2、10×pbs,250ml，biotnt，60元；
3、trizol，100ml，invitrogen，1600元；（biotnt提供更多灌装产品，400元/20ml）4、1.5ml闷存管，无吉龙德，已杀菌，存有砌，axygen，100两支/纸盒，1355、无菌rnase-freeeppendorf管(1.5ml)，axygen，1000两支/纸盒，91
聚氨酯泡沫
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议