的影响及临床意义
浙江大学医学院外科学（泌尿外）
朝鲜族语言
９５级临床医学七年制硕士王仁定
导师陈江华教授
中文摘要
ｆ１．引言
新型免疫抑制剂的应用明显降低了肾移植术后急性排斥的发生，改善了短期效果，但人，肾的存活并没有同步提高。并且长期应用免疫抑制剂带来许多严重的副作用，包括肾毒性，增加机会感染，加速动脉硬化以及增加恶性肿瘤的发生等。因此，不应用免疫抑制剂而提高人，肾的存活，诱导移植免疫耐受是移植界共同的理想。 目前．诱导移植免疫耐受方法很多，包括放疗＋供体骨髓植入，供体特异性输血，应用单克隆抗体，供
合成化学体特异性骨髓输注等，而肾移植术后供体特异性骨髓细胞（Ｄｏｎｏｒ．ｓｐｅｃｉｆｉｃＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＣｅｉｌｓ，ＤＢＭＣ）输注诱导供体部分特异性免疫耐受是被认为比较现实的措施，具有较丈的临床应用前景。虽然，ＤＢＭＣ诱导免疫耐受机制不甚清楚，但自１９９３年Ｓｔａｒｚｌ提出细胞移行与嵌合体是移植物被接受并长期存活的基础以来，不少学者认为ＤＢＭＣ诱导免疫耐受可能与其促进嵌合体的产生和维持有关。
迈阿密研究中心最近的系列研究提示ＤＢＭＣ输注可以提高人／肾的存活，促进嵌合体的形成，降低急慢性排斥，而嵌合体的形成在诱导和维持免
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疫耐受中起重要的作用。国内单中，１３，对未进行ＤＢＭＣ输注肾移植受者外周血嵌合体检测，结果提示嵌合体随着时间推移，其出现的频率是增加的。
在国内，由于缺乏操作性良好的ＤＢＭＣ获取技术，限制了有关ＤＢＭＣ输注与移植免疫耐受的研究。自１９９９年１月起，浙江大学附属第一医院肾脏病中心建立了具有较强可操作性的供体椎体骨髓的获取技术，率先开展肾移植后供体特异性骨髓输注的前瞻性临床对照研究，至２００１年１２月共完成６３例受者的供体特异性骨髓输注，同期未进行ＤＢＭＣ输注病例４２５例。同时发现ＤＢＭＣ输注是安全的，对嵌合体的定性检测提示ＤＢＭＣ输注早期有促进嵌合体形成的作用。
目前国内外检测嵌合体的方法主要为定性方法包括本中心已建立ＰＣＲ．ＳＳＰ和ＰＣＲ．ＳＲＹ法。由于不能量化分析，易受各种因素的影响，且分√
辨率不高，因此Ｊ本课题拟建立定量检测嵌合体的ＰＣＲ—Ｆｌｏｗ方法，对肾移，
植受体外周血单个核细胞嵌合体的存在进行检测；并通过对浙一肾脏病中心ＤＢＭＣ输注病例的嵌合体检测及对照组的比较，试图了解在国人中，按浙一肾脏病中心的模式进行ＤＢＭＣ输注，ＤＢＭＣ对肾功能、急性排斥及嵌合体的影响，Ｋ期存活未进行ＤＢＭＣ病例中嵌合体的情况。
ｒ２．实验方法
２．１实验检测部分
男性性工作者排除肾移植术前接受外周血输注，未保存供、受者术前淋巴细胞标本，术后多个时间点未留取外周血淋巴细胞标本及供受者ＨＬＡ—ＤＲ位点分型完全相同的病例，共选择肾移植术后联合ＤＢＭＣ输注病例３６例（ＤＢＭＣ组）、同期配对病例中选取２６例（配对对照组）。５年以上长期存活女性病例１５例（长期病例组）。对上述各组在相应时间点（ＤＢＭＣ组及配对对照组：术前、术后１周、术后４周、术后８周、术后２２．２６周、术后４４．５２周、
术后５２周以上；长期病例组：门诊随访时）留取外周血淋巴细胞标本，经ＤＮＡ抽提、供受体ＨＬ
Ａ．ＤＲ位点确定后．利圳供体特异性位点通过ＰＣＲ．ＦＩｏｗ方法检测供体细胞。模拟不同比例的嵌合体以确定方法的敏感性，并利用普通ＰＣＲ扩增、产物电泳、凝胶成像和分析，以确定方法的特异性。２．２临床部分
１９９９年１月至２００１年１２月，本中心共进行尸体肾移植４８８例，排除多器官联合移植，二次移植，早期死亡（１月内），延迟复功等后４６９例。观察组６３例，其中男性４４例，女性１９例，平均年龄４５．３岁（３３－６４岁），术后免疫抑制剂方案为：环孢素＋骁悉＋强的松（ｃ＋Ｍ＋Ｐ）５４例，普乐可复＋骁悉＋强的松（Ｆ＋Ｍ＋Ｐ）９例，供体骨髓分３次输入，总量为（６．１±１１）×１０９他。对照组４０６例，其中男性２７１例，女性１３５例，平均年龄３９．８岁（１５－７０岁），术后免疫抑制方案为：ｃ＋Ｍ＋Ｐ３６４例，Ｆ＋Ｍ＋Ｐ４２例。两组均不应用抗淋巴细胞球蛋白制剂诱导。
３．实验结果
３．１实验检测部分
３．１．１各组间基本情况的分析快乐在微笑中漫步
通过夤方检验、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ精确检验和两个独立样本的Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｍｏｖ检
验．比较ＤＢＭＣ组与配对对照组的性别（Ｐ＝０７９８）、左右供肾（Ｐ＝０．６０７）和年龄（Ｐ＝０．８６７）构成，提示无明显差异。
３１２方法敏感性和特异性的检验
通过对模拟单个核细胞嵌合体ＰＣＲ．Ｆｌｏｗ的检测，确定本实验方法可至少检测出０．０５％水平的嵌合体，并对每一对引物经原位ＰＣＲ后抽提全部的ＤＮＡ，以检测方法的特异性，结果发现经原位扩增后，抽提、电泳得到所需目的片段，且未见扩增产物外渗。
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３．１３嵌合体随时程变化
术后４周ＤＢＭＣ组与配对对照组相比有非常明显差异，为９．２０±８．０３％与１．２９±２．０５％（Ｐ＜０．叭）：８周两组比较有非常明显差异，为７．７３±７．３５％与０．７６±１．９３％（Ｐ＜００１）：术后６月以后各时间点两组之间无统计学差别。同时实验发现同一个体在不同时间嵌合体可以消失和再现现象。
３１．４ＤＢＭＣ组嵌合体与急性排斥
ＤＢＭＣ组２人在术后２－３月发生排斥，其嵌合体量为０．５７±Ｏ．０３％，同组同一时间点未发生排斥的嵌合体为８．５８±７．３３％，无统计学差别（ｐ＝Ｏ．１５）。３．１．５长期病例与嵌合体
在排除了外周输血等干扰因素后．长期肾功能稳定的病例其嵌合体的量达Ｏ．５９±０．７０％，其中有２６．６７％（４／１５）嵌合体的量超过１％，２６．６７％（４／１５）在检测中未发现嵌合体，４６．６７％（７／１５）其嵌合体的量在０％．１％之间。
国际化学年
３，２临床部分
３．２．１两组情况的分析
通过卡方检验、Ｆｉｓｈｅｒ’Ｓ精确检验和两个独立样本的Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｍｏｖ检验，比较观察组与对照组的性别（Ｐ＝Ｏ．６２７）、和年龄（Ｐ＝Ｏ．３２５）构成，及术后两组免疫抑制剂方案（ｘ２＝Ｏ．８７４；ｐ＝０３５），均无显著性差异。
３．２．２ＤＢＭＣ输注与肾功能
对观察组及对照组病例的肾功能分析发现两组最近随访终点肌酐（包括失功者开始透析前及带功死亡前肌酐）水平，观察组比对照组略低为１１５．４±３３．Ｏｕｍｏｌ／Ｌ和１２４．７±６１．６ｕ
ｍｏｌ／Ｌ。但两组肌酐超过正常值（＞１３３ｕｍｏｌ／Ｌ）患者人数，观察组１７．５％（１１／６３），对照组２２．９％（９３／４０６）（ｐ＝Ｏ．３３），无差异。
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２００２年浙江大学硕士学位论文３．２．３ＤＢＭＣ输注与急性排斥
观察组和对照组急性排斥（经病理和临床证实）发生率分别为３．１７％（２／６３）和１１．５８％（４７／４０６）（ｐ＝Ｏ．０４５），因排斥而失功分别为Ｏ％（０／２）｝１１１７．０２％ｃｓＨ，，ｃ一＝·．。。，，但无统计学差别√形７
０结论：
Ｌ移１．实验建立了以ＰＣＲ联合流式细胞仪的ＰＣＲ—Ｆｌｏｗ法，该方法敏感性为Ｏ．０５％。
ｂ２．肾移植联合供体骨髓输注在术后早期（２．３月内）促进嵌合体形成。
、套３．肾移植联合供体骨髓输注能减少急性排斥的发生，并减轻急性排斥的程度。但ＤＢＭＣ输注降低急性排斥是否与促进嵌合体有关尚需进一步研究。‰４．长期肾功能良好的女性受体中嵌合体的比例较高。
稻螟赤眼蜂
关键词：肾移植骨哆ｒ该合体排斥ＰＣＲ－Ｆｌｏｗ《ｉ砂
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