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细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2020, 36(12) •论著• 文章编号:1007 -8738(2020)12-1118 -06
非小细胞肺癌患者外周血T 淋巴细胞亚与NK 细胞活化性受体的表达 及临床意义 杨冀'，刘星池2，于颖I，于卉影'* (北部战区总医院：'临床基础医学实验室，2胸外科，辽宁沈阳110016)
收稿日期：2020-06-30；接受日期:2020-11 -24 作者简介：杨冀(1988 -)，女，辽宁辽阳人，技师，硕士
Tel ： 138****9490； E-mail ： imyj_903@ 163. com
* 通讯作者，于卉影，E-mail : hyingy@ sina. com
［摘要］目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血中淋巴细胞亚比率分布、自然杀伤(NK)细胞表面活化性受体和调 节性T 细胞(Treg)的表达水平及临床意义。方法 选取42例NSCLC 患者，根据肿瘤分期分为I 期+ II 期组和ID 期+ IV 期组；
根据分化程度分为高分化组、中分化组和低分化组。同时设良性病变组和健康对照组。采用流式细胞术检测外周血淋巴细胞 亚、NK 细胞细胞毒性性受体3(NCR3/NK P 30)和NCRl/NKp46和Treg 表达水平。结果 与健康对照组相比，DI 期+ IV 期组
患者CD3* T 细胞比例显著增加；DI 期+ IV 期组和高分化组患者CD3 + CD4* T 细胞比例显著增加；各分期组和低分化组CD4*
T 细胞中Treg 比例增加；I 期+ II 期组和中分化组NK 细胞比例显著增加；各分期组和中、低分化组NK 细胞NKp30和NKp46
表达明显降低。结论NSCLC 患者外周血T 细胞、Treg 、NK 细胞比例增加，但NK 细胞表面其活化性受体水平降低。［关键词］非小细胞肺癌；淋巴细胞亚；自然杀伤细胞毒性受体(NCR)；调节性T 细胞(Treg)［中图分类号］R392. 12, R331. T44, R392, R734.2 ［文献标志码］A
肿瘤的发生、发展及预后与机体的免疫状态密 切相关，一些前瞻性研究指出淋巴细胞亚、调节性 T 细胞(regulatory T cells , Treg)和自然杀伤(natural
killer, NK)细胞活化性受体具有成为肿瘤临床免疫 靶点和作为预后生物标志物的潜在可能UT , NK 细胞表面活化性受体表达水平髙，患者预后较
西安医学院第一附属医院
好；在不同肿瘤中Treg 的表达与其临床预后则具有
差异。NK 细胞具有无需致敏直接杀伤靶细胞的功 能，其杀伤活性依赖于活化性信号和抑制性信号的 平衡⑷。NK 细胞表面活化性受体主要有自然杀伤细太阳能热泵
胞毒受体(natural cytotoxicity receptor , NCR )，包括
NCRl/NKp46、NCR2/NKp44 和 NCR3/NKp30、NK
细胞受体 2 成员 D ( natural-killer receptor group 2, member D, NKG2D)、DNAX 辅助分子 1 ( DNAX
accessory molecular-1 , DNAM-1)，这些活化性受体可 以识别靶细胞表面的特异性配体，发挥杀伤作用。近年来，关于肿瘤与免疫系统的研究更多的集
中在肿瘤微环境中的免疫细胞和免疫分子。相对于
肿瘤浸润性免疫细胞，外周血免疫细胞能够更加全 面地反映机体的整体免疫状态，并且对于晚期或不 具备手术条件的患者，外周血相较于组织更容易获 得。因此，外周血免疫细胞的检测在评估患者免疫
状态、判断预后以及指导临床用药等方面，更具有临
床应用价值。肺癌是我国最为常见的恶性肿瘤，据
统计2015年我国肺癌的发病率和死亡率均居全国各 类肿瘤首位㈤。非小细胞肺癌(non-small cell lung
cancer , NSCLC )约占所有肺癌80% ，其中以腺癌和鳞状
细胞癌为主。本研究观察了 NSCLC 以及肺癌相关疾病
患者外周血淋巴细胞亚和NK 细胞活化性受体的表达 水平，并探讨其在NSCLC 疾病进展中的潜在评估价值。
1材料和方法
11材料
淋巴细胞亚检测试剂盒、异硫氤酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate , FITC)标记的抗 CD4 抗体
(CM-FTTC), FITC 标记的抗 DNAM-1 抗体(DNAM-1/ CD226-FITC)，藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的
抗CD8抗体(CD8-PE)、PE 标记的抗NKp46抗体
(NKp46/CD335-PE)、PE 标记的抗 NKG2D 抗体
(NKG2D/CD314-PE)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白复合
物(peridinin-chlorophyll-protein complex , PerCP )标记
的抗CD3抗体(CD3-PerCP )、别藻蓝蛋白 (allophycocyanin , APC)标记的抗叉头盒 P3 ( forkhead box P3, FOXP3)抗体(FOXP3-APC), APC 标记的抗 CD56 抗体(CD56-APC)、APC-Cy7 标记的抗 NKp30
抗体(NKp30/CD337-APC-Cy7) , APC-Cy7 标记的抗
CD25 抗体(CD25-APC-Cy7 )和固定透膜(Fixation/ Permeabilization )液均购自 BD Biosciences 公司。
选取2019-09 - 17/2020 -01 -21期间北部战
区总医院胸外科和肿瘤科收治的原发性NSCLC 患 者。纳入标准：组织病理学检查确诊为NSCLC ；未 接受过化疗、放疗、手术、免疫抑制剂和其他对免疫
12期 杨冀，等.非小细胞肺癌患者外周血T 淋巴细胞亚与NK 细胞活化性受体的表达及临床意义
1119
系统有影响的药物；临床分期和组织学分型均依据 国际肺癌研究协会制定的肺癌TNM 分期标准。排除 标准：合并其他恶性肿瘤；其他内科合并症；自身免
疫性疾病。研究共纳入42例NSCLC 患者，腺癌 23例、鳞癌19例，年龄为47 ~ 84岁，平均年龄 61.97岁，男24例，女18例。同时选取12例肺部良普光气田
性病变患者（包括炎性假瘤、肉芽肿、结核、错构瘤
bsa等）和12例健康志愿者。
肿瘤患者根据肿瘤分期和分化程度进行分组, 分为I 期+ n 期组和皿期+ IV 期组、高分化组、中等 分化组和低分化组（表1）。同时设立健康对照组和 良性病变组。
表1检测分组情况
n
mo
57
2 1
3
4 9 2
如如妇妇如如如
o 6 2
5 1 1 8 4 7 13T ~
m b ,
夕对照组1257.75 ± 6. 1良性病变组1261.42 ±9.49I 期+ II 期组3162.48 ±&44ID 期+ IV 期组1159.71 ± 3.3高分化组862.60 ±13.26中等分化组1662.38 ±7.33低分化组
14
60.85 ± 6.95
12方法
1.2. 1 流式细胞术检测淋巴细胞亚比例及相关受
体表达 每管加入EDTA-K2抗凝血100応，加入淋巴
细胞亚检测抗体（包括CD3-FITC 、CD56-PE, CD45- PeiCP 、CD19-APC, CD8-APC-Cy7 和 CD4-PE-Cy7 ）、 CD4-FITC 、CD8-PE 、CD3-PerCP 、CD56-APC 、CD226-
FTTC 、CD335-PE, CD337-APC-Cy7、CD314-PE O 振荡混
匀，避光室温孵育30 min，另设一管为阴性对照。加入1 mL 红细胞裂解液，室温裂解5 min，离心弃上清。PBS
洗涤2次，流式细胞术进行检测分析。
1.2. 2 流式细胞术检测Treg 比例 每管加入
EDTA-K2抗凝血IOO jx L，加入表面染抗体CD4- FITC 和CD25-APC-Cy7进行细胞表面染，避光室
温孵育30 min 。加入1 mL 红细胞裂解液，室温裂解 5 min, PBS 洗涤1次。加入0.5 mL 新鲜制备的固定
透膜工作液重悬，避光室温孵育20 min 。用1 mL 透
膜缓冲液洗涤细胞，离心弃上清。加入FOXP3-APC
抗体，避光室温孵育30 min, 1 mL 透膜缓冲液洗涤 细胞2次，流式细胞术进行检测分析。
1.2.3统计学分析 本研究采用SPSS17. 0统计软
件进行独立样本t 检验和方差分析。数据采用云士s 表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NSCLC 患者外周血CD3 + CD4+T 淋巴细胞和
NK 细胞增加
与健康对照组相比，皿期+ IV 期组患者外周血
中CD3+ T 细胞和CD3 + CD4 + T 细胞比例显著增加；
I 期+ II 期组患者外周血中CD3 - CD56+ NK 细胞比
例显著增加（P<0.05，图1A 、B ）。各组外周血中的
CD3 + CD8+ T 细胞、CD3 - CD19 + B 细胞（B lymphocyte ）
和 CD3 + CD56+ 自然杀伤 T （ natural kiUer T, NKT ）样细
胞比例没有明显差异（图IB ）。由于ID 期+ IV 期组患者
外周血中CD3+ T 细胞比例的增加以CD3 * CDT T 细胞
为主，而CD3 + CD8+T 细胞表达比例没有变化。因此, 皿期+ IV 期组患者外周血CE4/CD8比值高于其他3组,
但差异无统计学意义（P >0.05，图1C ）。
与健康对照组相比，高分化组患者外周血中 CD3 + T 细胞和CD3 * CD4 + T 细胞比例增加 （P<0.05），中分化组患者外周血中NK 细胞比例增
加（P<0.01）。同样，各组外周血CD3 + CD8 + T 细
胞、B 细胞和NKT 样细胞比例无明显变化，差异无 统计学意义（图1D ）。与健康对照组和良性病变组相
比，高分化组患者和中分化组患者中T 细胞的CD4/ CD8比值增加，而低分化组患者的CD4/CD8比值低
于对照组和良性病变组（图1E ）。
為超联世昌A
--------•• CD3-卜 11C □对照组
目良性病变EU I 期+ II 期组□ III 期+1V 期组
cm~
B
按超症4=：尋
'CD19-APC
B (
％)呈
=5
EJ
关
o o o o o O
0 8 6 4 2o
o o o o
0 8 6 4 2a T n n H H H M
T 宀
CD
)s
c - .-■ 炸
三=._三一三一
=)J
c
NK B
□对照组
昌良性病变组M 高分化组□中分化组S 低分化组
B
卜
A O Li d ，寸 G o
>CD8-APC-Cy7
T
K N c e
虽
OO Q U
、寸
a u E
茅亠
800
、寸
00
A ：流式细胞术检测淋巴细胞亚比例；
B ：不同肿瘤分期患者和健康 人外周血淋巴细胞亚比例；
C ：不同肿瘤分期患者外周血CD4/CD8
比值；D ：不同肿瘤分化程度患者和健康人外周血淋巴细胞亚比例； E ：不同肿瘤分化程度患者和健康人外周血CD4/CD8比值.a P < 0.05, ” <0.01 vs 对照组.
图1外周血中各类淋巴细胞亚构成和CD4/CD8
比值
1120细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Imnnmol )2020, 36(12)
2.2 NSCLC 患者外周血NK 细胞的NCRl/NKp46 和NCR3/NKp30表达降低
与健康对照组相比，I 期+11期组和皿期+W 期组患 者外周血中NK 细胞表面受体NKp30和受体NKp46
表达明显减少。并且外周血NK 细胞表面受体NK P 30
和NKp46在健康对照组、良性疾病组、I 期+ II 期组
和HI 期+ IV 期组的表达呈逐渐降低趋势。另外两种
活化性受体DNAM-1和NKG2D 在各组患者外周血
NK 细胞上的表达无明显变化，差异无统计学意义
（图 2A 、B ）。与健康对照组相比，高分化组患者、中分化组患
者和低分化组患者外周血中NK 细胞表面受体 NKp30表达降低，差异具有统计学意义
（P<0.05，图2C ）；中分化组患者和低分化组患者 NK 细胞表面受体NKp46表达降低，差异具有统计学
意义（P<0.01，图2C ）。并且外周血NK 细胞表面
受体NKp30和NKp46的表达随着肿瘤分化程度的降
低而逐渐减少。另外两种活化性受体DNAM-1和 NKG2D 在各组患者外周血NK 细胞上的表达变化不
明显，差异无统计学意义（图2C ）。
I 期+11期组 中分化组离分化组
中分化组
m 期+iv 期组 低分化组
I 期假分化组
□对照组
昌良性病变组H 1期+ II 期组 a 川期+iv 期组
> NKp30-APC-Cy7> NKp46-PE
o
o
o 5 0 5
B
(％)詈
N N
丄b l -I
------
o
o
o 5 0 5
c
(
％)
□对照组
邑良性病变组呱高分化组 因中分化组@低分化组
b H —a l —|
-:J ;.」
T B S -H.
壬三
IL--1
一；厂
X I
工二=f = .= 1 三二-+ti
NKp30 NKp46 DNAM-1 NKG2D
NKp3()
NKp46 DNAM-1 NKG2D
A ：流式细胞术检测外周血中NK 细胞表面活化性受体NKp30、NKp46, DNAM-1和NKG2D 表达；
B ：不同肿瘤分期患者和健康人外周血NK 细胞表面活化 性受体表达水平；
C ：不同肿瘤分化程度患者和健康人外周血NK 细胞表面活化性受体表达水平.导<0.05, ”<0.01 %对照组.
图2 外周血中NK 细胞表面活化性受体NKp30、NKp46、DNAM-1和NKG2D 表达水平
2.3 NSCLC 患者外周血Treg 比例增加
低分化组患者外周血CDT T 细胞中Treg 的比例明显高
与健康对照组相比，瑚+卿组和皿期+ W 期组患者 于健康对照组（P <0.05） ； CDT T 细胞中Treg 的比例在外周血CDT T 细胞中Treg 的比例显著增加（图3A 、B ）。
高分化组、中分化组和低分化组中逐渐增加（图3C ）
。
12期 杨冀，等.非小细胞肺癌患者外周血T 淋巴细胞亚与NK 细胞活化性受体的表达及临床意义
1121
对照组
良性病变组
I 期+11期组
高分化组
【II 期+W 期组
低分化组
缘毛鸟足兰
—
—> CD25-APC-Cy7C
(％)
昙專
H +K I O
A ：流式细胞术检测外周血Treg 比例；
B ：不同肿瘤分期患者和健康人
外周血Treg 比例；C ：不同肿瘤分化程度患者外周血和健康人Treg 比 例.ap<0.05, bp <0.01 力对照组.
图3外周血中CD4+ T 细胞中Treg 比例
3讨论机体的免疫功能与肿瘤的发生发展密切相关,
免疫功能异常导致其对肿瘤的监视和杀伤作用减弱,
从而发生肿瘤细胞的异常增生和扩散，大多数恶性 肿瘤患者存在免疫功能障碍⑷。越来越多的研究证
A
明肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes , TIL)在评估肿瘤患者预后中的价值-8]，而目前关
于外周血淋巴细胞亚的评估预后的研究较少。
本研究观察了 NSCLC 患者外周血淋巴细胞亚
的分布情况，结果显示：与健康对照组相比，NSCLC
患者外周血中CD3+ T 细胞和CD3 + CD4+ T 细胞比
例增加。类似地，在喉鳞状细胞癌中，与无淋巴转移
的患者相比，有淋巴结转移患者外周血中CD3+ T 细 胞和CD4+T 细胞比例升高⑼。然而，也有研究发
现，恶性肿瘤(包括肺癌、食管癌、鼻咽癌、子宫颈 癌、直结肠癌和乳腺癌)患者外周血中CD3+ T 细胞 和CD4+T 细胞较健康对照人下降[问。提示不同
肿瘤患者外周血中CD3 + T 细胞和CD4+ T 细胞表达
水平有差异。
CD4/CD8比值是评价免疫系统平衡的一个重要
指标，有助于反映机体免疫反应的调节能力⑴〕。在
本研究中，由于NSCLC 患者外周血中CD4+ T 细胞 的比例增加，导致CD4/CD8比值高于对照组，且随
着肿瘤分化程度的减低而逐渐升高。关于外周血中 CD4/CD8比值与肿瘤患者预后的研究结果并不一
致，胰腺癌患者外周血中CD4/CD8比值较低的患者
生存期较好「⑵。而在原发性中枢系统淋巴瘤[⑶和
卵巢癌E 研究中，外周血CD4/CD8比值较高的患者
的无进展生存期较长。同样，在不同肿瘤的TIL 中
CD4/CD8比值与其预后的关系也存在很大差异，乳
腺癌〔切患者的TIL 中CD4/CD8比值高预示患者预
后差，而食道鳞状细胞癌"和口腔鳞状细胞癌患
者的TIL 中CD4/CD8比值低预示患者预后差。上述
研究结果的差异，可能是由于肿瘤种类不同或研究 中选取的界值不同而产生的。CD4+CD25 + FOXP3 +
Treg 因其能够分泌白细胞介素35 ( interleukin-35 ,
IL-35)、IL-10 和转化生长因子 3 (transforming growth
factor-p, TGF-p)等抑制性细胞因子，并且通过下调
T 细胞信号分子或诱导肿瘤患者T 细胞凋亡而导致
免疫耐受和免疫抑制而被认为是一抑制性细胞亚 购。在本研究中NSCLC 患者外周血CD4+ T 细胞
中Treg 的比例高于健康对照组，并且随肿瘤分化程
度的降低Treg 比例的逐渐增加。这与一项进展性胃 癌的研究相似，预后较好的肠道型患者外周血CD4 +
T 细胞中Treg 比例高于预后较差的弥散性和混合型,
而TIL 中Treg 表达没有差异3〕。研究显示，可以通
过特异性抗体(例如细胞毒T 淋巴细胞相关蛋白4)
来消耗Treg 或降低其活性，从而到达肿瘤的目 的a 。】。CD8 +细胞毒性T 淋巴细胞的杀伤功能依赖
于CD4+辅助性T 细胞分泌的IL-21 [21-22]，在本研究
1122细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2020,36(12)
中NSCLC患者外周血CD3+CD4+T细胞比例的增加，并以抑制性Treg增加为主，因此表现为患者肿瘤的恶性程度越高，其外周血中CD4/CD8比值越高。
对NSCLC患者外周血NK细胞活化性受体检测发现，与健康对照组相比，NSCLC患者外周血NK细胞表面的活性受体NK P30和NKp46表达明显减少，并且NKp30和NKp46的表达水平随着肿瘤的分期和分化程度加重逐渐降低，活性受体NKG2D和DNAM-1表达没有变化。同样地，与健康供体相比，胃癌患者外周血NK细胞上NK P30和NKp46的比例降低，并且与肿瘤进展呈正相关血]。在一项关于急性髓
性白血病的前瞻性研究中发现，外周血NK细胞上NKp30表达高的患者有更长的生存期和无复发生存期，提示NK P30可以作为一个早期监测急性髓细胞白血病预后的生物学标志物⑦-旳。IV期黑素瘤患者外周血中NKp46转录本的表达水平低于健康人和早期患者，并且低表达NKp46转录本的患者生存期较短沟。在培养物中添加NKp46抗体可以提高NSCLC 患者夕卜周血单个核细胞Y干扰素(interferon-^,IFN-7)的分泌，表明在体外NKp46+NK细胞可以通过接触的方式恢复或增强1型辅助T(T helper type1,Thl)细胞抗肿瘤反应⑵】。这些研究结果提示外周血NK细胞上NCR的表达水平对肿瘤患者疾病的进展和预后有重要的影响，并且有可能成为肿瘤免疫的新靶点。
综上所述，外周血淋巴细胞亚是反映机体免疫功能状态的重要指标，本研究结果显示，NSCLC 患者外周血中CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞和Treg比例增加，NK细胞表面活化性受体NKp30和NKp46的表达水平降低，并且Treg和NCR的表达水平与肿瘤临床分期和分化程度密切相关，可用于监测疾病进展，并可能成为疾病潜在的靶点。
参考文献：
[1]Wang L,Simons D L,Lu X,et al.Connecting blood and intratumoral
Treg cell activity in predicting future relapse in breast cancer[J].
Nat Immunol,2019,20(9):1220-1230.
[2]Molfetta R,Zingoni A,Santoni A,et al.Post-translational mechanisms
regulating NK cell activating receptors and their ligands in cancer:
potential targets for therapeutic intervention[J/OL].Front Immunol,
2019,10：2557.DOI：10.3389/fimmu.2019.02557.
[3]Lijie L,Wang J,Chang D,et al.Clinical value of Pro GRP and T
lymphocyte subpopulation for the assessment of immune functions of lung cancer patients after DC CIK biological therapy[J].Exp Ther
Med,2018,15(2):1580-1585.
[4]Malgorzata G,Andrzej R.Effect of natural compounds on NK cell
activation[J/OL].J Immunol Res,2018,2018:4868417.
DOI：10.1155/2018/4868417.
[5]孙可欣，郑荣寿，张思维，等.2015年中国分地区恶性肿瘤发病
和死亡分析[J].中国肿瘤，2019,28(1)：1-11.
Sun K,Zhen R,Zhang S,et al.Report of cancer incidence and mortality in different areas of China,2015[J].Zhongguo zhong Liu,2019,28(1)：1-11.
[6]Gonzalez H,Hagerling C,Werb Z.Roles of the immune system in
cancer:from tumor initiation to metastatic progression[J].Genes Dev,2018,32(19/20):1267-1284.
[7]Maartje C A W,Brad H N.Prognostic significance of tumor-infiltrating
B cells and plasma cells in human cancer[J].Clin Cancer Res,
2018,24(24):6125-6135.
[8]Mihaela A,Roxana I N,Luciana N,et al.Tumor infiltrating lymphocytes:
The regulator of melanoma evolution[J].Oncol Lett,2019, 17(5):4155-4161.
[9]Filippo M,Francesco M,Fabiola I,et al.Prognostic significance of
peripheral T-cell subsets in laryngeal squamous cell carcinoma[J].
Laryngoscope Investig Otolaryngol,2019,4(5)：513-519.
[10]贡鸣，何天宇，裘敬平，等.6种常见肿瘤患者初治时外周血T
淋巴细胞亚数量及临床特征[J].中国医科大学学报，2018, 47(12):1119-1122.
Gong M,He T,Qiu J,et al.Peripheral blood T-lymphocyte subsets in patients with six kinds of cancer and their clinical characteristics during the initial treatment[J].Zhongguo Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2018,47(12):1119-1122.
[11]Alejandra P,Carmen C,Nelson L,et al.Immunosenescence:Implications
for response to infection and vaccination in older people[J].
Maturitas,2015,82(1)：50-55.
[12]Yang C,Cheng H,Luo G,et al.The metastasis status and tumor
burden-associated CAI25level combined with the CD4/CD8ratio predicts the prognosis of patients with advanced pancreatic cancer:A new scoring system[J].Eur J Surg Oncol,2017,43(11)：2112-2118.
[13]Ghesquieres H,Chevrier M,Laadhari M,et al.Lenalidomide in
combination with intravenous rituximab(REVRI)in relapsed/ refractory primary CNS lymphoma or primary intraocular lymphoma:a multicenter prospective'proof of concept'phase II study of the French Oculo-Cerebral lymphoma(LOC)Network and the Lymphoma Study Association(LYSA)[J].Ann Oncol,2019, 30(4):621-628.宾汉姆
[14]Waki K,Kawano K,Tsuda N,et al.CD4/CD8ratio is a prognostic
factor in IgG nonresponders among peptide vaccine-treated ovarian cancer patients[J].Cancer Sci,2020,111(4)：1124—1131. [15]Aye A T,Xiaoyang C,Valerie C Y K,et al.Higher densities of
tumour-infiltrating lymphocytes and CD4+T cells predict recurrence and progression of ductal carcinoma in situ of the breast[J].
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