王静 戚向阳
（华中农业大学食品科技学院，武汉 430070）
E-mail:kiki91094@sohu
摘 要：自Roberts发现儿茶素氧化产物茶黄素以来，人们对茶儿茶素氧化聚合物的研究已取得一系列可喜进展。本文就国内外关于茶儿茶素氧化聚合物的研究作一综述，包括儿茶素氧化聚合物的生物活性，提取制备及其分离纯化的方法，旨在为儿茶素氧化聚合物的研究提供新的思路。 关键词：茶儿茶素氧化聚合物；生物活性；制取；分离纯化惯量
1.引言
茶多酚又名茶单宁，属多酚类物质，是从茶叶中提取的多羟基酚类衍生物的混合物，以儿茶素为主体成分，占总酚含量的60%-80%[1]。儿茶素具有2-苯基苯并吡喃的结构，主要包括四种儿茶素类物质，即表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）。
河南发生纵火案大量研究表明，儿茶素具有抗氧化、抗癌、抗突变、降血糖、抑菌、抗病毒等多种生理功效[2-5]。其中儿茶素的抗氧化作用最为突出，被公认为高效低毒的天然抗氧化剂。但儿茶素性质不稳定，易发生氧化。过去人们常认为其酚羟基氧化后会导致其活性降低或丧失，但随后对儿茶素氧化产物的研究发现，其氧化产物表现出更为优异的生物活性。因此对儿茶素氧化产物的研究越来越受到人们重视。唐俊昌
儿茶素氧化聚合物种类繁多，最为常见的是茶黄素、茶红素等茶素类物质。其中茶黄素的各种性质已被研究的较为透彻。茶红素及其他儿茶素氧化聚合物的研究虽然不如茶黄素研究的深入，但也正处于不断的摸索发展中。
2.儿茶素氧化聚合物的生物活性
儿茶素氧化聚合物的抗氧化作用研究表明，茶儿茶素氧化聚合物在体外对不同体系产生的活性氧自由基有极强的清除作用，其清除率不低于茶多酚复合体。李春美等人用分光光度法测定了茶多酚及其氧化产物对不同体系产生的活性氧自由基O2·-和·OH的清除作用。结果表明，茶多酚及其氧化产物对邻苯三酚自氧化产生的O2·-均表现出较强的抑制作用，氧化产物的效果强于茶多酚；对脱氧核糖体系产生的·OH的最大清除率分别为83.4%和88.5%[6]。谢笔钧等人对儿茶素氧化产物——茶黄素进行研究，茶黄素中茶黄素单酯2B(TFM-2B)和茶黄素双酯(TFDG)对5-大豆脂肪氧合酶活性的抑制作用超过了EGCG，IC50分别为0.57µmol/L、0.23µmol/L、10.0µmol/L[7]。她们还用Na2S2O32I2滴定法测定
了茶儿茶素氧化聚合物对猪油和豆油的抗氧化作用，并以茶多酚作比较。结果表明，儿茶素氧化聚合物可有效地螯合过渡金
属离子，从而达到抑制油脂的自动氧化的效果。并得出结论：轻度的氧化聚合(聚合度≤5)不但不会破坏儿茶素类化合物的抗氧化活性，还有可能提高其抗氧化能力[8]。儿茶素氧化聚合物的高抗氧化活性是由于儿茶素的氧化过程中，酸性增强，而使氧化产物能形成更大的供氢体，因此儿茶素氧化产物有可能比儿茶素单体的抗氧化活性更强。Yoshino K.等应用纯化的茶黄素和茶红素对叔丁基过氧化氢诱导鼠肝匀浆脂质过氧化进行抗氧化活性研究。结果显示TF1、TF-3-G和TRs抑制脂质氧化的IC50分别为4.88×10-4％、4.09×10-4％和4.95×10-4％(W/V)，其抗氧化活性比谷胱甘肽、抗坏血酸、生育醇、BHT、BHA强，但比ECG、EGC和EGCG弱[9]。
自楼福庆1983年发现茶儿茶素氧化产物具有促纤溶，有效预防动脉粥样硬化症以来，学者们对其在心血管疾病方面的药效进行大量实验。李树裕等人用放射免疫分析法检测32例缺血性心脑血管病患者茶素前后血浆内皮素（ET）、降钙素基因相关肽（CGRP）含量的变化。ET是迄今所知体内最强的缩血管多肽，它与脑梗塞、急性心肌梗及高血压有密切关系[10]；CGRP具有加强心肌收缩力、舒张血管、降低血压等作用，是目前已知的最强的扩血管物质[11]。后与前比较，血浆ET及E/C比值显者降低(P＜0.01)，而血浆CGRP显著升高(P＜0.01)，表明茶素能显著降低ET，升高CGRP，调整E/C比值失衡[12]。彭兰等对茶素改善血液流变的研究表明，10项血液流变学指标中，
除红细胞压积(HCt)下降不明显外，全血比粘度(Gb)，血浆比粘度(Gp)，纤维蛋白原(Fb)，全血还原粘度(Gr)，红细胞电泳时间(EPT)，血小板粘附率(PAD)，血栓长度(EL)，血栓湿重(EMW)，血栓干重(EDW)，九项均较前有明显降低(P＜0.05)[13]。
儿茶素氧化聚合物还能阻断癌细胞增殖，抑制癌基因的表达。茶素对T淋巴细胞转化、自然杀伤细胞活性有明显的增强作用，还可明显抑制、苯并芘等诱导的细胞突变、基因与染体突变，以及放射线诱导的细胞癌变。它对香烟诱导的突变的抑制作用比维生素C、E、β胡萝卜素更强。吴永方等人首次对从茶素中分离出的单一组分TP-91进行抗肿瘤实验。研究发现，TP-91对小鼠s-180抑瘤率达43%；TP-91对荷瘤宿主的血浆凝固性、cAMP、免疫和SOD均有影响，给药后血浆凝固性下降，cAMP活性升高，SOD活性增强，外周血T 淋巴细胞百分率上升[14]。韩驰等人用一组体外短期检测试验，检验了茶素在肿瘤的起动、促进、增殖阶段的作用。结果发现茶素在肿瘤发生的起动、促进和增殖各阶段均显示出明显的保护作用。茶素可诱导醌还原酶(QR)活性和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性；在用二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌前病变，阳性对照组的GST水平有一定程度的降低，饮用0.1%茶素可显著诱导大鼠肝GST活性，诱导率为18%，而且GST1-1、1-2、3-3蛋白表达均有明显升高，说明茶素具有很好的抗肿瘤作用[15]。日本科学家1996年报道，使用儿茶素和红茶提取物（茶素），观察了其对大鼠肝癌致癌过程的抑制效应。结果发现，茶素可明显减少肝脏中肿瘤前期的谷胱甘肽S-转移酶胎盘形式病灶的数量和面积，从而表明茶素对肝癌的化学预防作用。
儿茶素氧化聚合物还同茶多酚一样有抑菌、抗病毒的功效。马庆一等报道了从茶叶中提
取的天然素的抑菌活性，茶素对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的MIC为0.025g/mL，对枯草杆菌的MIC为0.05g/mL；纯茶黄素和茶红素抑菌效果均比茶原液好[16]。Toed M.等也证实了TFs对金黄葡萄球菌的抑制作用。TF-3，3′-DG在0.5 mg/mL的浓度下可抑制须发癣菌和红发癣菌的生长[17]。Massao H.等研究发现TF1、TF-3-G、TF-3′-G和TF-3，3′-DG在1×10-3-10×10-3mol/mL浓度时对导致龋齿的细菌GTF(葡萄糖基转移酶)有强烈抑制活性，其抑制作用强度TF-3，3′-DG>TF-3-G>TF-3′-G> TF1> CG> GCG> ECG> EGCG[18]。
3.儿茶素氧化聚合物的制取
儿茶素氧化聚合物具有如此强大的生物活性，可作为很好的医药材料，因此对其高效的提取及制备方法成为人们关注的问题。众所周知，红茶、乌龙茶等属于发酵、半发酵型茶，在其制造过程中，儿茶素经多酚氧化酶及过氧化物酶氧化而形成茶黄素、茶红素等儿茶素类氧化聚合物，称为茶素。最早人们对此类氧化产物的提取主要是通过从红茶茶汤直接用沸水提取，再经浓缩、脱脂、干燥后而得，但从红茶茶汤中沸水提取的方法得率极低，茶黄素仅为0.2%-2.0%。李大祥等人以斯里兰卡红碎茶为原料，用乙酸乙酯萃取制备了茶黄素、茶红素，其得率分别为10%和40%，并通过控制不同制备条件，来达到茶素制品化学成分的最佳配比[19]。
后来人们常采用体外模拟氧化方法来制取儿茶素氧化产物，如体外酶促氧化。其实早在1957年，Roberts就对儿茶素进行体外酶促氧化实验，得到了茶黄素等氧化聚合物[20]。随着科技的发展，对体外酶促氧化体系的研究出现一些创新。夏涛等人对茶鲜叶匀浆悬浮发酵，探讨了发酵体系中温度、pH及悬浮液浓度对红茶素形成的影响，并证明该体系具有发酵均一、操作性强等优点[21]。为了增加发酵体系中的溶氧量，提高酶活，促进儿茶素的酶促氧化，人们又进一步创建出了双液相酶促系统，使得茶黄素的制取得率提高，茶黄素含量可达45%[22]。屠幼英等人还利用固定化技术提高多酚氧化酶的稳定性，催化高纯度的茶多酚生产出高纯度的茶黄素，茶黄素总量为78.94%[23]。
化学氧化方法同样也被用来模拟儿茶素体外氧化。与酶促方法相比，它可消除酶提取纯化的难度，酶性质的不稳定性，反应程度难以控制以及受氧气的制约等因素的影响，大大简化了反应体系，可控性较强，而成为研究茶儿茶素氧化机理及其氧化产物形成的一种简便而有效的方法。李大祥等人通过研究茶儿茶素的化学氧化与酶促氧化的反应途径以及氧化产物，证实了化学氧化同样可以生成茶黄素类物质，但在氧化途径上，与酶促氧化存在差异，指出化学氧化由于消除了酶促氧化的二个主要因子(酶、氧气)的影响，从而使化学氧化变得简便、迅捷[24]。并探讨了pH、温度、氧化时间对茶黄素类生成量的影响，表明pH主要是影响TF2的形成，而温度则主要是影响TF1、TF3、TF4的形成，氧化时间对其影响不大，且在生成的茶黄素类中，TF1+TF2的生成量远远大于TF3+TF4的生成量[25]。王坤波等人以K3Fe(CN)6和NaHCO3为氧化剂，在碱性条件下氧化儿茶素，以茶黄素总量为指标，探索了
儿茶素的组成、反应物浓度与氧化剂的量比对氧化途径和氧化产物的影响。结果表明，以大叶儿茶素为
材料，儿茶素浓度为10 mg/mL，儿茶素︰K3Fe(CN)6︰NaHCO3为2:3:1时，有利于最大茶黄素总量的形成[26]。儿茶素同样也可在酸性条件下发生氧化，但此类研究并不多。李立祥对茶多酚进行了酸性氧化研究，发现茶多酚在有机酸及无机酸性盐环境中均可氧化，无机酸性盐更有利于茶多酚氧化形成茶黄素[27]，酸性条件下的氧化机制还需进一步研究。
体外模拟发酵体系中，还有一种自氧化的方法，即不加入任何氧化剂来制取儿茶素氧化聚合物，可消除氧化剂毒性残留的影响。自氧化方法一般是在绿茶浸出液中通入氧气，在加热的条件下使之转化成茶素等氧化聚合物。但得到的茶素中缺少茶黄素物质，存在较多高聚合茶红素类物质[28]。自氧化方法并不常用，还有待于进一步探讨和发展。
4. 儿茶素氧化聚合物的分离纯化
随着对儿茶素氧化产物药理作用认识的不断深入，愈来愈多的学者开始注意对儿茶素的氧化产物的分离分析，现在已形成了较为完善和成熟的分离分析方法，并对有些氧化聚合物单体的结构作出鉴定。早在1971年，Lea A.G.H.等应用Sephadex LH-20柱对红茶中茶黄素进了分离。竹尾忠一等应用Sephadex LH-20柱将红茶水浸出物进行柱层析分离，以30%、40%、50%的丙酮顺序梯度洗脱，结果
分离出茶黄素三个峰[29]。随后柱层析法越来越多的被运用到儿茶素氧化聚合物的分离。人们将Sephadex LH-20柱层析法与其他方法相结合可分出氧化产物单体。Shengmin Sang等人将EGCG与EC进行酶促氧化，氧化聚合物先以40%丙酮为洗脱液，过Sephadex LH-20柱，再以50%甲醇为洗脱液，过RP C-18柱分离，得到两种产物。其中一种产物通过APCI-MS和1H和13C NMR被鉴定为theaflavin 3-gallate （TF3G）；另一种产物为TF3G进一步氧化后所得，被鉴定为theadibenzotropolone A，是红茶中首次发现的儿茶素三聚体，该化合物中含有两个苯骈卓酚酮结构，分别由EGCG的B 环、D环分别与一分子EC的B环形成苯骈卓酚酮结构[30]。R G Bailey等人将从绿茶中提取的ECG进行化学氧化，氧化产物过Sephadex LH-20柱，以60%丙酮为洗脱液，得红棕产物和黄产物两级分，黄产物级分再经Solka-Fioc纤维素柱，同样用60%丙酮洗脱，得到单一组分，经FAB-MS及2D NMR鉴定为TF-3，3′-DG，其结构中的苯骈卓酚酮环来源于ECG B环的3′、4′-二羟基苯环与D环没食子酸酯基团的3〞、4〞、5〞-三羟基苯环，偶联氧化形成[31]。Matias对EC进行酶促氧化，经不同溶剂萃取后得四个级分的氧化产物。将级分Ⅰ以甲醇为流动相用Sephadex LH-20分离，得到的单一组分经鉴定为茶碘烷酸酯A。级分Ⅳ经13C-NMR测得为儿茶素低聚体，Matias进一步利用Waters Spherisorb S5-ODS2柱和TSK-Gel G2500HR柱对儿茶素低聚体进行分离分析，发现高效液相谱和凝胶排阻谱的联合使用可对EC的二、三、四、五聚体有很好的定性和定量作用[32]。Takashi等人对绿茶多酚进行酶促氧化，氧化产物过Sephadex LH-20柱，用甲醇梯度洗脱，最后用50%丙酮洗脱，共得到四个级分。其中级分Ⅱ进一步过MCI-gel CHP20P和ODS柱，用甲醇梯度洗脱，得到EC与E
GC的氧化产物，经MS、NMR鉴定为dehydrotheaflavin，分子量为578；级分Ⅳ经ODS柱谱分离得到另一种产物，为EGCG的偶联二聚体，分子量为886[33]。
高速逆流谱法（HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一项新技术，可以在短时间内实现高效分离和制备，并达到几千个理论塔板数的分离效果。江和源等首次将高速逆流谱法应用在分离纯化茶黄素上，经过比较研究，最终选择甲醇︰水︰乙酸乙酯︰正己烷(1︰6︰3︰1，v/v)作为溶剂系统进行茶黄素单体的分离[34]。刘莉华采用HSCCC与Sephadex LH-20凝胶柱层析相结合的分离方法，对茶黄素单体进行了二步分离纯化。结果表明，使用HSCCC，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水四元溶剂系统可将茶黄素混合物有效分为三个部分。同时结合Sephadex LH-20柱层析，可使茶黄素达到高纯度的分离纯化[35]。目前，利用高速逆流谱分离儿茶素氧化聚合物的技术尚未成熟，还有很多尚需通过试验和论证的地方。但相信凭借其独有的优势，今后应用必将广泛。此外，毛细管电泳技术、纸层析、薄层层析等方法都可用于茶儿茶素氧化聚合物的分离。
5.前景展望
国内外很多对茶儿茶素氧化聚合物的研究报道证实了茶儿茶素氧化聚合物在调节血脂、抗氧化、抗肿瘤降血糖等多方面显示出突出的生物学活性，甚至有些方面优于儿茶素类。这些研究为儿茶素氧化聚合物的应用奠定了基础。随着研究的不断深人，也必将开拓更多的应用领域，如可将其开发成保健品
、牙膏、化妆品等日化原料。但由于儿茶素氧化聚合物成分复杂，迄今为止还没有一种较好的方法能将儿茶素氧化聚合物中各个组分完全分离纯化，目前多数研究的是多种混合物的药理作用。因此，对儿茶素氧化聚合物分离纯化新方法、新技术的要求极为迫切。同时，进一步研究每一种儿茶素氧化产物的药理作用仍然是一个艰巨的任务。
相信随着研究工作的不断深入以及科学技术的发展，茶儿茶素氧化聚合物在多方面的药理作用将被广泛地应用于各种相关疾病的临床，从而为人类造福。
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