古代航海技术
人参研究GINSENG RESEARCH2011年第4期
朱启光郑友兰韩佳宏蔡恩博徐蕊郝旭梅王慧珠
（吉林农业大学中药材学院·吉林长春·130118）
摘要：目的研究大叶蟹甲草不同萃取部位的抗氧化活性。方法采用ABTS、DPPH自由基及还原性反
应体系，利用分光光度法测定大叶蟹甲草的总提液、乙酸乙酯层、正丁醇层和石油醚层在不同
浓度下的抗氧化能力及其总酚含量。结果大叶蟹甲草的不同萃取部位对ABTS、DPPH自由基 均具有较强的清除能力及还原能力，其结果与浓度呈良好的量效关系。其中乙酸乙酯层抗氧化
能力最强，在浓度为0.62mg/mL时，对ABTS自由基的最大清除率为91.57%，对DPPH·的最大
清除率为94.87%，与同浓度VC的清除率接近，且其IC50分别为0.066mg/mL、0.004mg/mL，测
得乙酸乙酯层总酚含量最高，达10.45%。大叶蟹甲草具有较好的抗氧化能力，其中乙酸乙酯层
抗氧化能力最显著，与总酚含量有较大的相关性，同时该结果也客观地反映了DPPH法、ABTS·+
法及还原性法测定大叶蟹甲草抗氧化活性的准确性。
关键词：大叶蟹甲草；抗氧化；总酚；相关性
Antioxidant activity from different extractione of cacalia firma kom Zhu qi-guang,Zheng You-lan,Han jia-hong,Cai En-bo,Xu Rui,Hao Xu-mei,Wang Hui-zhu
（College of Chinese Medicinal Material,Jilin Agricultural University,ChangChun,130118）
Abstract:Object:study on the antioxidant activity from different extraction of cacalia firma kom.Methods:Using ABTS,DPPH radical and reducing reaction,determination the total extracts,Ethyl acetate,butanol layer and layer of cacalia firma kom.in different concentrations of the antioxidant capacity and total phenolic content.Results:The results showed a good dose-concentration relationship.The acetidin fraction of cacalia firma kom.Show the most potent antioxidant activities in each assay.When the concentration of0.62mg/mL,showing91.57%in the ABTS radical scavenging,94.87%in the DPPH radical scavenging.With the same concentration of the radical scavenging close to the VC.And each IC50are0.066mg/mL、0.004mg/mL.Therefore,our study verifie
d that the butanol fraction has strong antioxidant activities which are correlated with its high level of phenolics.
The phenolics concent of the acetidin fraction is2.9（mg/20mg）.Conclusions:The cacalia firma kom.has good antioxidant capacity.The acetidin fraction antioxidant capacity significantly,And total phenolics content have a greater correlation.
Meanwhile,the results also reflect the ABTS o+method is objective,DPPH method and reducing method for the determination of antioxidant activity of cacalia firma kom.
Keyword:Cacalia firma kom.；Antioxidant；Total phenolics；Relativity
大叶蟹甲草（cacalia firma kom.）为菊科（composi-tae）蟹甲草属（Parasenecio firmus（Komar.）Y.L.Chen）[1]植物，又名大叶兔儿伞，在民间作为山野菜食用。蟹甲草属植物约有50种分布在中国[2]，据报道在我国民间有26种该属植物可作为传统中药[3]应用，具有祛风除湿、消炎止咳及消肿止痛等功效，用于风湿关节痛、、支气管炎、跌打损伤、咳血、痢疾、水肿等疑难杂症[4、5]。近代药理研究表明：蟹甲草属植物具有抗氧化[6、7]、抗肿瘤[8、9]、抗癌[10、11]、抗菌活性[12]及杀虫作用[13、14]。目前，对大叶蟹甲草植物的研究在国内外均未见报道。因此，本论文为开发大叶蟹甲草资源提供了理论依据。
目前，大量资料已经证明：炎症、肿瘤、衰老、血液病、以及心、肝、肺、皮肤等各方面疑难疾病的发生机理与体内自由基产生过多或清除自由基的能力下降有着密切的关系。由于抗氧化剂对由自由基引起的机体损伤有干扰作用，而被公认为是一种新的途径，在预防医学领域里，对抗氧化剂研究兴趣空前高涨。合成的抗氧化剂虽然抗氧化性能较好，但有一定的副作用。所以，开发研究抗氧化作用的天然药物是
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人参研究GINSENG RESEARCH2011年第4期朱启光等：大叶蟹甲草不同萃取部位抗氧化活性研究
目前研究的重中之重。
本文采用DPPH、ABTS、还原性3个抗氧化模型来对大叶蟹甲草不同萃取部位进行体外抗氧化活性筛选，并探讨大叶蟹甲草不同萃取部位总酚含量与其抗氧化活性[15]的相关性，为其在食品、药品等领域开发新的天然抗氧化剂提供一定科学依据。
1实验材料、仪器与试剂
1.1实验材料
药材采于吉林省临江市，由吉林农业大学园艺学院胡全德教授鉴定为菊科（compositae）蟹甲草属（Parasenecio或cacalia）植物大叶蟹甲草（cacalia firma kom.）地上部分。
1.2仪器与试剂
仪器：T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；百灵LA114型电子天平（110g/0.0001g）（常熟市百灵天平仪器有限公司）；KQ—250DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE52-05旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；移液（20ul）（上海肯强贸易有限公司）。
试剂：DPPH溶液，蒸馏水，无水乙醇，甲醇，ABTS，过硫酸钾，铁，磷酸盐缓冲液（PH=6.6），三，三氯化铁，抗坏血酸(以下用Vc表示)（上海惠世生化试剂有限公司，批号：080408），Folin-Cio-calteu试剂，无水碳酸钠。
2实验方法
2.1药材的提取
取大叶蟹甲草样品3.5kg，粉碎后分别用10倍，8倍，6倍量的75%乙醇浸泡过夜，超声30min，静置过滤，合并滤液，减压浓缩，蒸干得总提取物。加适量蒸馏水稀释成混悬液后，再分别用石油醚、乙酸
乙酯和水饱和正丁醇各萃取3次，分别合并萃取液，减压浓缩，蒸干，备用。
2.2样品溶液的制备
分别准确称取干燥至恒重的总提物、石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层萃取物30mg，用无水乙醇逐级稀释成浓度为0.000mg/ml，0.018mg/ml，0.037mg/ ml，0.075mg/ml，0.15mg/ml，0.31mg/ml，0.62mg/ml，1.25 mg/ml的样品溶液，待用。其中石油醚层加入DMSO （含量小于0.05%）。
2.3DPPH法测定抗氧化活性
2.3.1DPPH溶液的制备
精密称取DPPH样品0.01g，加入无水乙醇配置成浓度为0.04mg/mlDPPH溶液，整个过程都需要避光。2.3.2样品测定
将样品溶液按表1加入反应液，摇匀后于室温避光静置30min，在515nm处测定吸光度值，用VC作对照。
表1总提取物、石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层萃取物样品溶液加样表
激光笔Table.1Composition of total extract，aether petrolei extract，EtOAc extrace，BuOH extract solution
DPPH清除率%=（A-B+C）/A*100
2.4ABTS法测定抗氧化活性
2.4.1ABTS．+溶液的制备
5ml，14mM的ABTS和5ml，4.9mMk2S2O8混合产生ABTS+，黑暗中静止16h，使用之前用乙醇稀释成备用的ABTS+，要求其在734nm波长下的吸光度为0.70±0.02。
2.4.2样品测定
取3mlABTS+样品溶液加入158ml样品(Asam-ple)，用乙醇做空白，3ml ABTS+和158ml水为标准(Acontrol)，6min后在734nm波长下测定吸光度，用VC作对照。
清除率（%）=[（A control–A sample）/A control]×100%
2.5还原性的测定
取样品溶液2.5ml，加入2.5ml，0.2mol/ml，pH6.6磷酸盐缓冲液和2.5ml1%K3Fe（CN）6，混合均匀（1:1: 1），于50℃反应20min。取出再加入2.5ml10%三。而后于离心机中以200转离心10min，
取上层溶液2.5ml加入蒸馏水2.5ml，0.1%FeCl30.5ml（5:5:1），用分光光度计于700nm波长处测定吸光值，以VC作为对照。
2.6总酚含量测定
取样品20mg于10ml容量瓶中，用甲醇定容，取0.5ml样品溶液于25ml容量瓶中，加入Folin-Ciocal-teu（福林酚试剂）2.5ml，在0.5至8分钟范围内间断加入2ml7.5%无水Na2CO3（75g/L），在50℃水浴中加热5min，冷却后用蒸馏水配平，760nm处测吸光度值，用蒸馏水作对照。
3结果与讨论
3.1结果
3.1.1对DPPH自由基的清除能力(见图1)。
A3ml无水乙醇+3mlDPPH·溶液
B3ml样品溶液+3mlDPPH·溶液
C3ml样品溶液+3ml无水乙醇
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人参研究GINSENG RESEARCH2011年第4期
图1.不同浓度下大叶蟹甲草不同萃取部位对DPPH自由基清除能力
Fig.1DPPH radical-scavenging activities of differ-ent extraction of cacalia firma kom．by different solvents at different concentrations.
由图1可知，不同VC及浓度下大叶蟹甲草的不同萃取部位DPPH法清除自由基能力大小为：VC＞乙酸乙酯层＞正丁醇层＞总提液＞石油醚层，随着浓度的增加，各样品清除DPPH的能力也不断增强，当浓度为0.075mg/ml时，乙酸乙酯层清除率接近同浓度VC 的清除率。
3.1.2对ABTS自由基清除能力(见图2)
图2不同浓度下大叶蟹甲草不同萃取部位对ABTS自由基清除作用
Fig.2.ABTS radical-scavenging activities of differ-ent extraction of cacalia firma kom．by different solvents at different concentrations.
由图2可知，不同浓度下大叶蟹甲草的不同萃取部位ABTS法清除自由基能力大小为：VC＞乙酸乙酯层＞正丁醇层＞总提液＞石油醚层，随着浓度的增加，各样品清除ABTS的能力也不断增强，当浓度为0.620mg/ml时，乙酸乙酯层清除率接近同浓度VC的清除率。
3.1.3还原性作用见图3。
图3.不同浓度下大叶蟹甲草不同萃取部位的还原能力
Fig.3.Ferric reducing activities of different extrac-tion of cacalia firma kom．by different solvents at differ-ent concentrations.
由图3可知，不同浓度下大叶蟹甲草的不同萃取部位还原能力大小为：VC＞乙酸乙酯层＞正丁醇层＞总提液＞石油醚层，当浓度为0.620mg/ml时，乙酸乙酯层还原能力接近同浓度VC的还原能力。
3.1.4大叶蟹甲草不同萃取部位的抗氧化活性及总酚含量测定
3.1.
4.1清除DPPH和ABTS的IC50值及总酚含量(见表2)邵晰
表2大叶蟹甲草不同萃取部位的抗氧化活性及总酚含量
Table3.The activities and the phenolics content of different extraction of cacalia firma kom．
由表2可知，乙酸乙酯层的总酚含量最高，达1.45%，DPPH法测得的VC的IC50值为0.001mg/ml，大叶蟹甲草的乙酸乙酯层的IC50值为0.004mg/ml。ABTS 法测得的VC的IC50值为0.025mg/ml，大叶蟹甲草的乙酸乙酯层的IC50值接近于VC，为0.066mg/ml。
3.1.
4.2相关性分析(见表3)
利用SPSS16.0分析得DPPH与总酚的ρ值为-0.811、ABTS与总酚的ρ值为-0.815。相关系数ρ是一个无量纲的数值，且-1≤ρ≤1，ρ>0为正相关，ρ<0为负相关，ρ的绝对值接近于1，说明相关性越好，ρ的绝对值接近于0，说明相关性越差。
由表3可知，大叶蟹甲草中总酚的含量与其对DPPH自由基及ABTS的清除能力呈负相关，这为我们更好开发大叶蟹甲草资源提供一定的科学依据
表3相关性分析结果
Tab.3Results of test of Correlations
Sample
IC50（mg/ml）Phenolics
Content（mg/
20mg）
DPPH法ABTS法
大叶蟹甲草乙酸乙酯层0.0040.066 2.9±0.1大叶蟹甲草正丁醇层0.0570.088 2.1±0.5大叶蟹甲草石油醚层0.7740.3300.6±0.3大叶蟹甲草总提液0.1910.128 1.0±0.4 VC0.0010.025--
DPPH ABTS Phenolics Pearson Correlation（ρ）-.811-.815
奥运五环Sig.(2-tailed).189.185
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3.2讨论
建筑施工安全管理论文
3.2.1
本文采用体外方法考察了大叶蟹甲草不同萃
取部位的抗氧化活性，结果表明：大叶蟹甲草具有较强的抗氧化能力，能明显地清除DPPH 、ABTS 自由基，并且具有较好的还原能力，随着样品浓度的增加，大叶蟹甲草的抗氧化能力也随之增强，并呈现良好的量效关系。
3.2.2由表3可知，DPPH 与总酚的ρ值为-0.811、ABTS 与总酚的ρ值为-0.815，说明DPPH 和ABTS
的清除率与总酚含量呈负相关，且相关性很大，这为更好的开发大叶蟹甲草资源提供一定理论依据。
3.2.3由图1、图2、图3可以看出，不同浓度下大叶蟹
甲草的不同萃取部位中，乙酸乙酯层清除DPPH 、
ABTS 自由基，还原能力，及总酚含量均高于其他萃取部
位，且清除率接近同浓度下VC 的清除能力。由此可确定大叶蟹甲草中抗氧化活性部位为乙酸乙酯层，这为深入研究大叶蟹甲草抗氧化活性成分奠定了基础，为大叶蟹甲草抗氧化活性成分的提取分离指明了方向。
负压病房
3.2.4本实验通过对大叶蟹甲草不同萃取部位抗氧
化活性的研究，从大叶蟹甲草中筛选出了总酚含量高，且抗氧化能力强的活性部位，这为寻高效、无毒的天然抗氧化剂提供新的药用来源，更为其在食品、医药等领域开发新型产品提供参考依据。
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