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从糖蜜酒精废⽔中提取抗氧化和清除⾃由基的活性颜料
五合国际
摘要
⽤⼤孔树脂吸附法从糖蜜酒精废液提取⾊素。并且对颜料的抗氧化和清除⾃由基的活性进⾏了研究。⼤孔树脂吸附的五个特性，包括HPD-600, HPD-500, D301-R, NKA-IIand D296-R进⾏了研究表明HPD-600是最适当从糖蜜酒精废液中提取的⾊素。⽤硝酸，羟基⾃由基，超氧阴离⼦⾃由基和1，1-⼆苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）在外部环境进⾏模型系统，从⽽对从酒精废液中提取的⾊素的抗氧化和清除⾃由基的活性进⾏评估。⾊素提取物浓度依赖于⾃由基所在系统的清除活性。同时，DPPH体系中⾊素的提取物的活性被发现( P < 0.05) ⾼于其他系统，其50％抑制浓度（IC50值）为0.07毫克/毫升。⾊素提取物的IC50值⼤于10毫克/毫升时清除超氧阴离⼦⾃由基的作⽤是⾮常微弱。 关键词：糖蜜酒精废⽔；颜料;⾃由基，抗氧化活性
1前⾔
糖蜜是发酵⼯业最重要的原料之⼀在于于其低廉的成本和⼴泛可⽤性。⽢蔗糖⼚的糖蜜是⼀个丰富的资源，因为它是⽣产酒精的发酵过程的主要原材料。⽢蔗糖蜜含有2％深褐⾊的⾊素名为⿊精，影响酒精废
⽔的颜⾊。⿊精是Maillard 反应的最终产品之⼀是由低和⾼的分⼦量聚合物组成，这是⼀个⾮酶褐变反应之间的反应产⽣的还原糖和氨基化合物。同时，从上述产业的糖蜜酒精废⽔中除了其他着⾊剂，如酚，饴糖和⿊⾊素仍含有类⿊精⾊素。⽢蔗糖蜜废⽔中含有丰富的酚类化合物。⽢蔗糖蜜酒精⽣产可能会导致⼤量废⽔，引起严重的环境关注。其废⽔特点具有极其⾼化学需氧量（COD），⽣化需氧量（BOD）和深褐⾊。运⽤活性污泥系统，曝⽓法和厌氧池的正常的⽣物处理很难使这些颜料脱⾊。对各种物化⽅法进⾏了探讨，如活性炭吸附，膜处理和氧化处理，但成本⾼，使得这些⽅法很难被采⽤。因此，到⼀种去除这种⾊素的⽅法是很重要的。
根据许多研究报告说，⽢蔗提取物具有良好的抗氧化活性。虽然据报道，⿊精和酚类化合物具有强的抗氧化剂，但从糖蜜酒精废液⾊素的抗氧化活性来说这⼀点信息基本是不可⽤的。因此，本研究的⽬的是从糖蜜酒精废液⾊素的提取和纯化，并评估其抗氧化和⾃由基的活性。
2材料的和⽅法
2.1颜料浓缩浆的制备
糖蜜酒精废⽔是从以⽢蔗糖蜜为原材料的⾦⼴糖⽢蔗⼚(中国⼴西）采集的。然后过程是进⾏离⼼预处理（8000克10分钟）以去除不溶性物质。颜料通过膜过滤进⼀步得到浓缩浆分⼦量达30000。
地源热泵换热2.2⼤孔树脂对⾊素的吸附
⼤孔树脂HPD-600，HPD-500，D301-R，NKA-II and D296-R被⽤来作为吸附剂。其物理性能列于表1。⼤孔树脂及丰富的蒸馏⽔⽤来除去盐和杂质。吸附实验前，吸附剂⽤⼄醇洗涤，然后⽤蒸馏⽔取代⼄醇进⾏最后的洗涤。
⼤孔树脂从糖蜜酒精废液⾊素的吸附试验进⾏如下：颜料浓缩浆⽤蒸馏⽔稀释20倍与碱液混合，分别在250毫升锥形瓶中加⼊五个不同的⼤孔树脂（2.0克），盖上盖⼦。再加⼊稀释⾊素溶液（100毫升）。然后瓶被放置在太赫兹-82A 型号摇床摇匀了（130转），2⼩时后在25°C下⽤紫外/可见分光光度计在560 nm 的波长使⽤蒸馏⽔作为空⽩测定溶液的吸光度。根据下⾯计算吸附率的公式：
（2—1）其中Ar是测试样品（％）的吸附率，A0是⾊素吸附前溶液的吸光度，A1是⾊素吸附后溶液的吸光度。
2.3解吸试验
解吸过程进⾏了如下：HPD-600⼤孔树脂吸附2.0 g⽤蒸馏⽔清洗，然后加⼊100毫升⼄醇⽔溶液（分别为
甲基丙烯酸甲酯
20％，40％，60％）在250毫升锥形瓶中进⾏解析。瓶被放置在太赫兹-82A模型摇床和摇匀（130转），2⼩时后在25°C下⽤紫外/可见分光光度计测定吸光度。按照下列式⼦计算解吸率：
（2—2）其中Dr是解吸率（％），A0是⾊素吸附前溶液的吸光度，A1是⾊素吸附后溶液的吸光度。A2是解吸后⾊素⼄醇溶液的吸光度。
2.4⾊素的提取制备
⼤孔树脂吸附颜料进⾏浓缩处理，然后污⽔被集中在⼀个旋转真空蒸发）在45℃解吸后。冷冻⼲燥得到的粉状⾊素进⾏提
空气轴承
取。
2.5抗氧化活性的测定
2.5.1亚硝酸盐的去除
Saha,Lajis,and Israf(2004)and Zhang, NieTao,and Ye(2002)对此⽅法进⾏了⼀些修改。对⾊素的提取
与蒸馏⽔稀释到合适的浓度进⾏分析。三毫升的颜料加⼊到样品管（10毫升），然后加⼊2毫升柠檬酸缓冲液（pH值3.0）和分别加⼊0.1毫升200微克/毫升亚硝酸钠，最后加⽔⾄⼗毫升。混合物⽴即⽔浴在37°C 保温60分钟。Griess试剂等体积（磺胺1％，0.1％的N-（1 -萘基）⼄⼆胺盐
酸，2.5％磷酸）的加⼊上述混合物。吸光度在10分钟后⽤紫外/可见分光光度计（Dojin，⽇本）在538 nm处测定。在同⼀时间对照溶液（不含亚硝酸钠）和标准（没有NaNO2⽆⾊素样本）进⾏了测定。Vc和丁基羟基茴⾹醚（BHA）被作为阳性对照化合物。亚硝酸钠的去除使⽤下列公式计算：
（2—3）其中SA是测试样品的亚硝酸钠清除率（％），ODS是标准的OD值，ODP 是OD值在测试样品存在，ODC是OD值的对照值。
2.5.2羟基⾃由基（OHA）的的清除作⽤
羟基⾃由基清除活性测定⽤脱氧核糖法。反应在10 mM磷酸盐缓冲液（pH7.4），含过氧化氢2.8毫摩尔，2.8毫摩尔脱氧核糖，25uM FeCl3，100 uM EDTA和不同浓度的提取样品。加⼊抗坏⾎酸浓度100微摩尔，反应混合物在37°C保温1⼩时，在⽔浴反应被激活。培养后，加⼊1％的硫代巴⽐妥酸和冰冷的2.8％三氯⼄酸，在沸⽔浴20分钟（100℃）加热。样品冷却后在532纳⽶处测定吸光度。控制
自由落体运动实验反应混合物中不包含提取样品。Vc和丁基羟基茴⾹醚（BHA）被⽤来作为阳性对照化合物。清除作⽤的活性使⽤下列公式计算
（2—4）其中SA是清除活性测试样品（％），ASI是在被测样品的吸光度，ABI是对照吸光度。
2.5.3测定超氧阴离⼦⾃由基去除活性
超氧阴离⼦⾃由基清除活性是测定邻苯三酚做了⼀些修改。Tris-HCl缓冲液为50毫摩尔（5.6毫升）（pH8.2）和0.2毫升测试样品混合。然后将混合物在⽔中25°C保温10分钟同时，0.2毫升0.95毫摩尔的邻苯三酚在25°C预热后被添加。吸光度⽤紫外/可见分光光度计在325 nm处测定，每30秒测定样品和对照。曲线根据吸光度值绘制。VC被⽤作阳性对照化合物。去除活性使⽤下列公式计算：
（2—5）
其中SA是测试样品的抑制率（％），AS是测试样品的吸光度，Ab是对照样品的吸光度。
2.5.4 DPPH（1,1 - ⼆苯基-2-三硝基苯肼）⾃由基去除作⽤
1，1-⼆苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的⾃由基的去除根据西格玛分析法测定，（2毫升）⼄醇（2104 mol/L）和2毫升不同浓度测试样品混合。然后将混合液在⿊暗中保温60分钟，使⽤紫外/可见分光光度计在25°C下517 nm处测定吸光度下降值，甲醇作为空⽩。VC和⼆丁基羟基茴⾹醚（BHA）被⽤来作为阳性对
照化合物。⾊素对DPPH的清除活性根据下列公式计算：
（2—6）
其中SA是测试样品（％）的清除活性，Ai是DPPH⾃由基溶液2毫升和2毫升样品混合液的吸光度，Aj是2毫升样品溶液的吸光度和2毫升⼄醇混合液的吸光度，A0是2毫升DPPH溶液和2毫升样品溶剂混合液的吸光度。
2.6总酚类化合物的测定
⾊素的提取⽤景观⽔，以稀释合适的浓度进⾏分析。通过约福林Ciocalteau 酚试剂法对总酚含量⾊素的提取物进⾏了评估。样品提取液（200毫升）被添加到1.0毫升的福林，Ciocalteau试剂碳酸钠和0.8毫升（7.5％W/V）然后混合，并允许停留30分钟。⽤紫外可见分光光度计在765 nm处测定吸光度。
总酚含量⽤五倍⼦酸表⽰相当于（GAE）表⽰每克样品，⽤五倍⼦酸⽣成标准曲线。
2.7统计分析
所有实验进⾏⼀式三份，数据是标准值±标准差。最显着性差异（LSD）的试验与置信区间95％间隔是⽤来⽐较的⽅法。抑菌浓度50％（IC50）⽤来计算浓度/效果回归线。
3结果与讨论
3.1⼤孔树脂对⾊素吸附作⽤
五种⼤孔树脂对糖蜜酒精废液⾊素的吸附影响列于表2。
HPD-600和D301-R树脂的吸附能⼒明显（P <0.01）⾼于其他树脂和他们的吸附率分别为82.66±0.22％和87.18±0.13％。NKA-II的吸附能⼒最低，这与吸附⾊素的树脂的化学特性有关。极性吸附剂之间的匹配吸附是影响吸附的重要因素。⼤孔树脂吸附能⼒取决于其疏⽔性。因此，⼤孔树脂HDP-600具有⾼吸附效果和更低的成本被选中做了以下实验。
从糖蜜酒精废液提取⾊素吸附是⼀个很好的⽅法。活性炭是从废⽔中去除有机污染物的⼴泛使⽤的吸附剂，另⼀个吸附剂是天然的碳⽔化合物的聚合物壳聚糖。Lalov, Guerginov, Krysteva,and Fartsov⽤壳聚糖作为阴离⼦交换去研究酒⼚
废⽔的处理。但成本相对较⾼限制其使⽤。在这些效果⽐较好的吸附剂中，⼤孔树脂是更具吸引⼒的替代品，因为其⼴泛的孔隙结构和良好的理化特性。本次实验中使⽤是因为其⾼化学稳定性，优良的选择性和更低的成本。
3.2⼄醇溶液浓度对解吸的影响
⼤孔树脂的解吸溶剂⼀般是⽤不同浓度的⼄醇溶液，因为它可以很容易地回收和具有成本低，并没有对样品的毒性。⽤不同浓度的⼄醇溶液进⾏脱附测试，以到最合适浓度的解吸液。图1所⽰是⽤不同浓度的⼄醇（分别为20％，40％和60％）解吸⼤孔树脂的解吸率。起初，解吸率随时间的增加。但解吸率后的30分钟时间后基本不增加。⼄醇浓度从20％到40％解吸率明显升⾼（P<0.05）。⼄醇溶液（40％）显⽰具有最⾼解吸率（> 98％）。极性溶剂解吸和吸附之间的匹配是⼀个影响解吸的重要因素。因此，40％的⼄醇溶液作为解吸溶剂选择。
3.3亚硝酸盐对⾊素提取物清除作⽤
正如图2所⽰，⾊素提取物通过抑制亚硝酸盐的浓度依赖性来影响抗⾃由基的活性。亚硝酸盐的清除⾊素的提取活性随浓度的增加，但低于在相同浓度下的阳性对照化合物VC和BHA。VC和BHA只有在浓度的不断增加下（> 0.5毫克/毫升）略有增加。亚硝酸盐对⾊素的50％浓度提取液抑制作⽤所需量（约0.75毫克/毫升，⽽BHA和VC的约0.16毫克/毫升和0.18毫克/毫升分别。据悉，某些物质可以清除亚硝酸盐，因为他们的还原能⼒。它可以指出由下⾯的公式：NO2-+16H++12e-
=2NH4++4H2O。糖蜜酒精废⽔酚类⾊素有还原能⼒，这可能是它可以清除亚硝酸盐原因。
3.4提取⾊素的羟⾃由基的清除效果
羟基⾃由基是最活性⾃由基，可在有⾦属离⼦如铁或铜的存在条件下通过超氧化物阴离⼦和过氧化氢反应得到。羟基⾃由基可与⾎脂，多肽，蛋⽩质和DNA 反应，尤其是与硫胺素和鸟苷反应好。当羟基⾃由基与芳⾹族化合物发⽣反应，它可以添加横跨双键，⽣成六溴⼆羟基环⼰烯⾃由基。所产⽣的⾃由基可以进⾏进⼀步的反应，如与氧⽓反应，给过氧⾃由基，或分解⽔消除苯氧型⾃由基。
清除⾊素提取物对羟⾃由基的抑制能⼒如图3。⾊素提取物对羟基⾃由基清除活性剂量依赖性为0.25-1.25毫克/毫升，这可能是由于还原⼒，氢原⼦的提供和活性氧的去除作⽤的综合影响。然⽽，在相同
的浓度⾊素提取物对羟⾃由基清除活性显着（P <0.01）低于对照，VC和BHA。⾊素提取物的IC50值⾼于1毫克/毫升，⽽VC和BHA的分别约0.75毫克/毫升和0.62毫克/毫升。⾊素的提取酚类化合物可能是影响羟⾃由基清除活性。
3.5提取⾊素中超氧阴离⼦⾃由基的清除作⽤
超氧阴离⼦⾃由基是氧分⼦接受⼀个电⼦，这也是最初的⾃由基从电⼦传递所形成创建的简化形式系统。超氧阴离⼦⾃由基被称为是⼀个⾮常有害的种类为多数活性氧物种的先驱细胞成分。在内部环境产⽣的超氧阴离⼦⾃由基通过歧化反应可能会导致形成过氧化氢。
Vc去除超氧阴离⼦⾃由基活性⾼于提取的⾊素（见表3）。为了同时得到相同吸光度值，颜料提取所需的浓度较⾼。提取的⾊素以剂量依赖性⽅式清除超氧离⼦（清除活动率为42.9％在10毫克/毫升）（见表3）。动⼒学表明存在不同浓度具有相同清除机制（数据未显⽰）。提取的⾊素50％抑制浓度（IC50值）⾼于10毫克/毫升，但其VcIC50值低于0.6毫克/毫升，这表明⾊素的提取不是很强的超氧⾃由基清除剂。
3.6 DPPH⾃由基对提取⾊素的清除效果
DPPH⾃由基是具有⼀种质⼦的特征吸收⾃由基化合物，能明显降低暴露质⼦的⾃由清除剂。它被⼴泛接受，抗氧化剂对DPPH⾃由基清除，是由于他们贡
献氢的能⼒。该测试系统可⽤于表明清除化合物潜在的主要特征，从糖蜜酒精废液⾊素的提取⾃由基清除的活性决定于光在517纳⽶由于清除稳定DPPH⾃由基的吸收削减量。阳性DPPH试验表明，该提取的⾊素是⼀个很好的⾃由基清除剂。
图4表明提取的⾊素与标准VC相⽐有较好的DPPH⾃由基活性，伴随浓度的增加并具有较⾼DPPH⾃由基活性。提取的⾊素的DPPH⾃由基清除活性在相同浓度下低于VC和BHA，但其DPPH⾃由基清除能⼒活动⼏乎相同在⼀定浓度（约0.2毫克/毫升）相对于VC和BHA。颜料样本的50％抑制浓度（IC50值）为0.07毫克/毫升。IC50值较⾼，下DPPH⾃由基清除能⼒活性越低。
4结论
总之，在本研究中所取得的成果表明，⼤孔树脂吸附是对从糖蜜酒精废液提取的⾊素能有效地清除DPPH⾃由基和硝酸盐⼀种潜在⽅法。然⽽，提取的⾊素是不是良好超氧阴离⼦⾃由基清除剂。通过
监测抗氧化活性的⽅法可能不⾜以使⼀个有效的和彻底判断。所以⾊素提取在体内抗活性⽅⾯各组成进⼀步具体研究是必要的。
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