材料与方法
1.1主要试剂
正辛酸 天津市弗晨化学试剂厂 批号200101（分析纯）
硫酸铵 天津市四通化工厂（分析纯）
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB） Amresco批号T2007/10
二甲基亚砜（DMSO） 郑州化学试剂厂 批号20030224
十二烷基磺酸（SDS） 北京鼎国生物技术公司 Sigma进口分装 L5750
丙烯酰胺 沃德赛斯生物技术有限公司Sigma进口分装A8887
羊抗鸡IgY（FITC标记） Promega公司
低分子量标准蛋白质 中科院上海生物化学研究所
DAB Amresco C069
DTT Genview DH116-2
1.2 试剂的配制
1.2.1 提取蛋白用试剂的配制
（1）饱和硫酸铵溶液
(NH4)2SO4 760g，
蒸馏水（50～80℃） 1000mL
搅拌溶解20分钟，趁热过滤冷却后以浓氨水（NH3·H2O）调PH至7.0～7.4，配制好的饱和硫酸铵置4℃处置30 min以上，瓶底应有结晶析出，用时应置室温平衡后再用。
（2）醋酸缓冲液（0.06M,pH4.8）
醋酸钠 4.082g
冰乙酸 1.815g（约1.7 mL ）
1.2.1 ELISA用试剂床身
（1）包被液（0.05M pH9.6 碳酸钠缓冲液） 无水Na2CO3 1.59g
NaHCO3以身立教 为人师表 2.93g 蒸馏水加至1000 mL
（2）洗涤液（0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液）PBST
NaCL 8.0g
KCL 0.2g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4•12H2O 2.9g
吐温-20 0.5mL 蒸馏水加至1000 mL
（3）封闭液（1% BSA－PBST）
牛血清白蛋白（BSA） 1g
洗涤液 PBST 100mL
（4）底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液）
0.1M柠檬酸 (19.2g/L) 24.3mL
0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7mL
蒸馏水 50mL
（5）TMB底物使用液
TMB储存液（100mg溶于
10mLDMSO,4℃保存） 100µL
底物缓冲液 10mL
30%H2O2 10µL （临用新鲜配制）
（6）终止液（2M H2SO4）
H2SO4（96%） 22.2mL
蒸馏水 177.8mL
1.2.3 SDS-PAGE电泳用试剂
(1)10%（w/v）SDS溶液
十二烷基硫酸钠（SDS） 10g
蒸馏水 100mL （室温保存）
(2)10%（w/v）过硫酸铵（AP）
过硫酸铵 1g
蒸馏水 10mL （临用前新鲜配制, 4℃保存＜1周）
（3）30%丙烯酰胺混合液
丙烯酰胺 29.2g
二甲基双丙烯酰胺 0.8g 蒸馏水定容至100mL，棕瓶4℃贮存
（4）分离胶缓冲液（1.5M pH8.8Tris-HCl）
Tris 18.2g
少量蒸馏水溶解
HCl（1M） 调pH至8.8 蒸馏水定容至100mL，4℃贮存
（5）浓缩胶缓冲液（1.0M pH6.8Tris-HCl）
Tris 12.1g
少量蒸馏水溶解
HCl（1M） 调pH至6.8 蒸馏水定容至100mL，4℃贮存
（6） 2×LeammLi样品缓冲液
10%SDS 4 mL
甘油 2 mL
1.0M pH6.8Tris-HCl 2.8 mL
（7）电极缓冲液（10×）
Tris 30.3g
甘氨酸 144.2g
十二烷基硫酸钠（SDS） 10g 蒸馏水定容至1000mL，使用时10×稀释 （8）染液（0.25%（w/v）考马斯亮蓝R-250酸甲醇水染液）
考马斯亮蓝R-250 1.25g
甲醇 227mL
冰醋酸 46mL
蒸馏水 227mL
（9） 脱液（酸甲醇水脱液）
甲醇 50mL
冰醋酸 75mL
蒸馏水 875mL
1.3 耗材及主要仪器
自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化器厂SZ-93型
台式电子天平 北京赛多利斯Acculab
紫外可见分光光度计 UV-2102
倒置显微镜 日本Nikon
超声裂解仪 Cole-Parmer Instrument公司
安永宁自动酶联检测仪 Anhos Labtee Instruments Gmbh公司
台式离心机 北京医用离心机厂 LD5-2A型
96孔酶标板 江苏海门公司
垂直电泳槽 北京六一仪器厂
电泳仪（DYY-5） 北京六一仪器厂
手动可调式移液 大龙医疗设备（上海）有限公司
荧光显微镜 日本OLYMPUS
1.4 方法
1.4.1鸡的免疫 已做过
诺基亚51401.4.2 检测鸡卵黄抗体水平的间接 ELISA方法的建立[70][71][72][73]
间接ELISA程序按常规方法在96孔聚丙乙烯微量板上进行。以日本血吸虫可溶性抗原按一定稀释倍数包被板子；0.05%的PBS-Tween20（PBST）液洗涤6次，1min每次；1%的BSA-PBST封闭，洗涤同上；加入待测卵黄液样品，37℃孵育；同上洗涤后加入酶标记兔抗鸡IgG，37℃孵育；洗涤后加入新配制的四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，室温显；2M的H2SO4终止反应，酶标仪上测定各孔450nm处的吸光值（OD450nm）。 1.4.5.1 抗原最适包被稀释度的确定
将抗原用包被液（0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液）作1:50始倍比稀释包被酶标板，采集未免前鸡蛋为阴性卵黄作1:100 1:500 1:1000 1:2000稀释，四免后第15 d收集鸡蛋为阳性卵黄作1:1000 1:2000 1:4000 1:8000稀释，加入最佳工作浓度的酶标二抗，按间接ELISA方法进行，测定各孔OD凯里学院学报450nm值 ，方阵法确定抗原最适包被浓度和抗体的最佳稀释度。
1.4.5.2 抗原最适包被时间和温度的确定
将稀释的C.baileyi可溶性抗原以不同的方式包被，分别以4℃过夜（≥10 h），37℃孵育2h、10h后，加入阴阳性血清，按间接ELISA方法测定。
产品样本制作
1.4.5.3 特异性试验
阻断试验：将阳性鸡抗血吸虫卵黄液作1:100～1:1600稀释，每个稀释度加入等量稀释度的血吸虫可溶性抗原，37℃孵育阻断30min后，再进行ELISA测定，同时设相应对照，比较结果。
类属反应：对3份阳性鸡贝氏隐孢子虫卵黄样品按前述方法处理后进行ELISA测定，同步设血吸虫阳性卵黄、阴性卵黄作对照。
1.4.5.4 重复性试验
选择5份鸡抗血吸虫卵黄液样品在不同时间、相同条件下重复作ELISA测定，每个样品重复3次，比较试验结果。
1.4.5.5 试验样品的检测试验
分别采集实验组和对照组4免后第15 d卵黄样品各3份，用间接ELISA方法进行效价测定。
1.5 IgY抗体的收集纯化与测定
1.5.1 IgY抗体的分离纯化
1.5.1.1 IgY抗体的粗提
取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液（约10ｍL/枚）与灭菌单蒸水（D.W）按1：9稀释，充分搅拌混匀，调PH值至5.1～5.4，置4℃，6h以上或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心10min（10,000rmin-1，4℃），弃沉淀，获取上清液，即为粗提的IgY抗体。
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