临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验
酶免疫技术 复习资料汇编
概念：酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。既保留了抗体或抗原的免疫学活性，又保留了酶对底物的催化活性和生物放大作用。可通过酶对底物的显反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反应的敏感性。 一、酶免疫技术的特点
既保留了抗体或抗原的免疫学活性，又保留了酶对底物的催化活性和生物放大作用。可通过酶对底物的显反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反应的敏感性。
（一）酶的要求
一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有产物，用酶标记抗体或抗原
建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得以放大，保证测定方法的灵敏度，为此用于标记的酶应符合下列要求：
谓语助者 1.酶的活性要强，转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，活性保持稳定。
3.作用专一性强，无内源性酶或抑制物。
4.易于判断或测量，方法简单、敏感和重复性好。
5.无害，易得。
（二）常用的酶
1.辣根过氧化物酶（HRP）；
HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则
与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。HRP的纯度用RZ表示，它是以HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值来表示的。用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。本焕大师
田野调查法 2.碱性磷酸酶（AP）
AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）。
（三）常用的底物
1.邻苯二胺（OPD）：是ELISA中应用最早的底物，HRP的敏感底物之一。在HRP的作用下显橙黄，加强酸终止反应后呈棕黄，最大吸收峰在492nm波长。但稳定性差，易变，具有致癌性。
2.四甲基联苯胺（TMB）：HRP新型底物。经HRP作用后变为蓝，加入硫酸终止反应后变为黄，最大吸收峰波长为450nm。TMB具有稳定性好，成无需避光，无致突变作用等优点。缺点是水溶性相对较差。
3. 对-硝基苯磷酸脂（p-NPP）：p-NPP经碱性磷酸酶作用后的产物为黄对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。
4. 4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU）：β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物。酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。
（四）酶标记抗体或抗原
1.标记方法要求：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定。
2.常用的标记方法有戊二醛交联法和改良过碘酸钠法两种。
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细胞模型 3.常用的纯化方法有葡聚糖凝胶G-200／G-150过柱层析纯化和50%饱和硫酸铵沉淀提纯等。鉴定包括酶活性和抗体（抗原）的免疫活性鉴定。
（五）固相载体
1.要求：结合抗体或抗原的容量大；牢固地固定抗原或抗体；不影响抗体或抗原的免疫反应性，固相方法简便易行，快速经济。
2.种类：索爱m600i
（1）塑料制品：聚苯乙烯塑料，物理吸附；
（2）微粒：带有能与蛋白质结合的功能基团，易与抗体（抗原）形成化学偶联；
（3）膜载体：常有硝酸纤维素膜（Nc）、玻璃纤维素膜等微孔滤膜，物理吸附。
（六）包被与封闭：
包被的蛋白质浓度过低，需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除干扰。
二、酶免疫技术的分类
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