icELISA方法步骤

海德格尔此在间接ELISA职业病防治法2012检测药物抗体效价

一、目的：掌握该方法及应用

二、原理：本实验依据抗原抗体的特异性、可逆性反应为基本原理进行设计，在聚苯乙烯板（酶标板）上包被人工抗原（OVA-Hapten，1-10ug/mL），包被抗原和标准品竞争血清中抗体进行反应形成抗原抗体复合物，如果标准品浓度高，结合到包被原上的抗体少（反之亦然），洗板则洗掉。加入酶标二抗（RaMIG-HRP）后，用四甲基联苯胺（TMP）底物显，显越浅，吸收值（A450）越小，阻断效果越好，抗体特异性越高，反之，显越深，以此来检测样本中抗体的特异性。

锋电能源技术有限公司三、实验材料

（一）药品试剂

1.包被原 OVA-Hapten；2.血清抗体；3. RaMIG-HRP；4. 3、4号酶底物溶液；5.反应终止液2M H2SO4 ；6封闭液 5%猪阴性血清+95%PBST；7 标准品100-10ng/mL。

（二）仪器设备

1.微量加样器；2.酶标板

四、操作步骤

1.包被

（1）包被酶标板：方阵滴定法选择工作浓度（教师做），包被浓度2ug/mL。（2）包被稀释液的配制：1.59gNaCO3+2.94gNaHCO3+1L双蒸水即可；（3）加样：100uL/孔；4.温育：37℃ 2 h；（5）洗板：用PBST洗板3次，每次间隔3min。

2.封闭

（1）封闭液的配制：95%PBST+5%猪阴性血清；（2）加样：250uL/孔（3）温育：37℃ 1h；也可4℃过夜。（4）PBST洗板3次，每次间隔3min。

3.加一抗血清

（1）铺底：封闭液铺底，50uL/孔，12孔全加；（2）加标准品：第一孔加稀释过（100ng/mL）的标准品50uL/孔，之后倍比稀释至第10孔弃去，11孔作阳性对照（2）加

一抗：加稀释过的抗血清（1:1000）50uL/孔，至第11孔， 12孔不加作为空白对照;（3）温育：37℃ 30min；（4）洗板：PBST洗板3次，每次间隔3min。

孔数	1	2	仓库防火安全管理规则 3	科学信息 4	5	6	7	8	9	10	11	12
封闭液铺底	50	马明龙 50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
mAb效价	200	400	800	1600	3200	6400	12800
观察结果