郭仕伟 谱科学自从1903年俄国的茨维特发明了液固柱谱之后，已有近100年的历史，但是在20世纪末的20年以前所未有的速度发展，特别是进人生命科学。材料科学和信息科学时代，对分离分析提出越来越高的要求。气相谱法（GC）虽然分离效率、选择性、灵敏度都很高，但是它只适用于热稳定性好、易挥发的物质。高效液相谱法（HPLC）虽然不受热稳定性及挥发性的限制，可以分析热稳定性差。难挥发的物质，但是和GC相比，缺乏灵敏的通用型检测器，实验中需消耗大量的有机溶剂，特别是对于大分子物质因其分子扩散系数小、传质阻力大，使柱效率大大降低，以至于难以分离分子量大于2000的物质。经典电泳技术虽然和离心法、谱法一起成为分离生物高聚物最有效和最广泛应用的三大方法，对生物化学的发展起了重要的推动作用，但是这些电泳技术操作烦琐、费时、定量困难，也很难满足现代生命科学研究的要求。 Jorgeson钙镁离子和Lukacs在充分研究电泳理论。技术的基础上，将谱理论和电泳技术相结合，于本世纪80年代初从理论和实际两个方面发展了高效毛细管电泳，并迅速在全球范围掀起研究热潮。现在，高效毛细管电泳已经成为分离科学领域中极为重要的前沿课题之一。
一、电泳基本原理
电泳指带电粒子在电场作用下作定向运动的现象。电泳有自由电泳和区带电泳两类，分析工作者感兴趣的是区带电泳。区带电泳是将样品加于载体上，并加一个电场。在电场作用下，各种性质不同的组分以不同的速率向极性相反的两极迁移，此时不考虑样品与载体之间的相互作用，因此电泳不是一个谱分离过程。实际上，样品与载体之间总有一定作用力，人们就利用这种作用力，并与电泳过程结合起来，以期得到良好的分离。因此，电泳又称电谱。区带电泳总是在固体或类固体这类载体上进行，常用载体有滤纸（故称纸电泳）、凝胶（故称凝胶电泳），以及醋酸纤维膜、淀粉、琼脂高聚物等。
图5-1 区带电泳设备示意图
电泳设备简单，操作方便。图5-1就是区带电泳设备的示意图。在左右两边的电解质贮槽中，放入合适的电解质溶液，载体架于两槽之间。电解液通常是一种缓冲液，浓度约0.1mol·L-1。电解液体积要大，以防止电解产物扩散至载体上，最好在浸入载体的电解液
与插入电极的电解液之间有一隔板。载体上所加电压梯度为每厘米数十伏。高电压可以加速迁移，缩短分析时间，但电压梯度须增至每厘米数百伏。可将样品加入其载体一端的起始点。在各组分分离之后，用合适的方法，如喷洒显剂、紫外光照射等，使组分斑点出现，然后进行定性和定量分析。
二、高效毛细管电泳的发展
表1 高效毛细管电泳的发展历程
第一节 高效毛细管电泳装置
motorola
将开管柱气相谱理论与技术应用于经典电泳，从而诞生了一种新的高效的分离模式，高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis, HPCE)。它的性能在分离许多生化物质上要优于一般谱法。
图5-2 毛细管电泳仪结构示意图
高压电源供给Pt电极上的电压高达5-30kV。典型毛细管长约10-100cm，内径为25-100μm，其材料可以是熔融石英。为了分离需要，也可采用预先经化学或物理吸附改性的毛细管。一般通过加压到电解质缓冲剂容器中或在毛细管出口减压，强使溶液通过毛细管。两端缓冲剂必须定期更换，这是由于在实验过程中，离子不断地被消耗，阴极和阳极
缓冲液的pH值升高或降低。
被分析样品的加入可以通过两种方法来实现。一是重力注射，即把毛细管一端浸没在样品溶液中，将此溶液提升，超过另一端缓冲液液面约10cm，使样品进入毛细管。二是电动进样，即在数秒种内，加5KV的短脉冲，由于电渗流的作用，使5-50μL的样品进入毛细管。 常用的检测器有紫外吸收检测器，二极管阵列检测器、荧光检测器、采用碳纤维的安培检测器，以及电导检测器等。
第二节 高效毛细管电泳的理论
一、电泳法的基本原理
当带电粒子以速度υ在电场中移动时，所受到的电场力为
FE=qE
式中FE－电场力；q－溶质粒子所带的有效电荷；E－电场强度。
带电粒子运动时所受的阻力，即为摩擦力，
F=fυ
式中F－摩擦力；f－摩擦系数；υ－溶质粒子在电场中的迁移速度。
当平衡时，电场力和摩擦力相等而方向相反，
新标准英语第七册 qE＝fυ
所以 υ＝qE/f=qE/6πrη （球状粒子） or υ＝qE/f=qE/4πrη （棒形粒子）
r－表观液态动力学半径；η－介质粘度。
因为ξe=q/εr，用荷电粒子的zeta电势来表示：
υ＝εξe E/6πη（球状粒子） υ＝εξe E/4πη（棒形粒子）
由此可见，荷电粒子在电场中的迁移速度，除了与电场强度和介质特性有关外，还与粒子的有效电荷及其大小和形状有关。因此，粒子的大小与形状，以及其有效电荷的差异，就构成电泳分离的基础。
因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度（mobility，μ）而不用速度来描述荷电粒子的电泳行为与特性。电泳淌度（μep）定义为单位场强下离子的平均电泳速度，即
μep =υ/E
二、电渗流
当固体与液体相接触时，如果固体表面因某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带另一种电荷，在固液界面形成双电层，二者之间有电势差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动。把这种液体相对于固体表面移动的现象叫电渗现象。 电渗现象中液体的整体流动叫电渗流（electrOosmotic f1ow，简称EOF）。
毛细管电泳分离的一个重要特性是毛细管内存在电渗流。电渗流的来源如图5-3所示。
图5-3 电渗流的形成
1.电渗流的大小和方向
电渗流υeo的大小: υeo =μeoE
电渗淌度μeo: μeo=εoεζ/η
εo－真空介电常数；ε－电泳介质的介电常数；ζ－毛细管壁的zeta电势，它近似等于扩散层与吸附层界面上的电位。
在实际电泳分析中，电渗流速度υeo可通过实验测定：
υeo＝l/teo
式中，l－毛细管的有效长度；teo－电渗流标记物（中性物质）从进样端迁移至检测器的时间。
电渗流的方向决定于毛细管内壁表面电荷的性质。当缓冲液的pH在3以上，石英管壁上的
硅醇基(≡Si-OH)离解生成阴离子(≡Si-O-)，使表面带负电荷，它又会吸引溶液中的正离子，形成双电层，从而在管内形成一个个紧挨的“液环”。在强电场作用下，它自然向阴极移动，形成了电渗流。电渗流迁移率大小与缓冲液的pH值高低及离子强度有密切关系。pH值越高，电渗流迁移率越大；离子强度越高，电渗流迁移率反而变小；在pH为9的20mmol·L-1的硼酸盐缓冲液中，电渗流迁移率的典型值约为吕传赞2mm·s-1。pH值越小，硅醇基带的电荷越少，电渗流迁移率越小；pH值越大，管壁负电荷密度越高，电渗流迁移率越大。若在管内壁涂上合适的物质或进行化学改性，可以改变电渗流的迁移率。例如蛋白质带有许多正电荷取代基，会紧紧地被束缚于带负电荷的石英管壁上，为消除这种情况，可将一定浓度的二氨基丙烷加入到电解质溶液中，此时以离子状态存在的+H3NCH2CH2CH2NH3+，起到中和管壁电荷的作用。也可通过硅醇基与不同取代基发生键合反应，使管壁电性改变。
2.渗流的流型
由于毛细管内壁表面扩散层的过剩阳离子均匀分布，所以在外电场力驱动下产生的电渗流为平流，即塞式流动。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅速减小到零以外，其余部分几乎处处相等。这一点和HPLC中靠泵驱动的流动相的流型完全不同，图中表示HPCE中电
渗流与HPLC中流动相的流型及它们对区带展宽的影响。
图5-4电渗流和高效液相谱的流型（上图）及相应的溶质区带（下图）
A.电渗流； B.高效液相谱中的流型
在外加强电场之后，正离子向阴极迁移，与电渗流方向一致，但移动得比电渗流更快。负离子应向阳极迁移，但由于电渗流迁移率大于阴离子的电泳迁移率，因此负离子慢慢移向阴极。中性分子则随电渗流迁移。一般情况下，电渗流速度约等于一般离子电泳速度 的5－7倍。可见正离子、中性分子、负离子先后到达检测器。实验证明，不电离的中性溶剂也在管内流动，因此利用中性分子的出峰时间可以测定电渗流迁移率的大小。
因此，电渗流在HPCE中起泵的作用，在一次CE操作中同时完成正负离子的分离分析，而电渗流的微小变化会影响CE分离测定结果的重现性，改变电渗流的大小或方向可改变分离效率和选择性。
3.毛细管电泳柱效率
CE中的分离效率用理论塔板数N表示，其理论表达来源于谱理论，用Giddings方程定义为：
N=l2/σ产品质量的重要性2
式中l－有效长度，σ－区带中浓度分布的方差。
在理想CE中，（1）毛细管中的流液为平流，即塞式流动，溶质在柱中的径向扩散几乎完全忽略；（2）毛细管本身具有抗对流性，对流引起的峰加宽不明显；（3）没有或很少有溶质与管壁间的相互吸附作用，忽略吸附引起的加宽作用。此时，可认为溶质的纵向扩散是高效毛细管电泳中引起溶质峰加宽的唯一因素，这相当于谱速率理论中的第二项即分子扩散项对板高的影响，则：
σ2=2Dt (D－溶质的扩散系数)
因 t=l/υeo=l/μeoE
N=μeoE l/2D
由此看出，（1）表观电渗淌度大，工作电压大，扩散系数小，都可使N大，分离效率高；（2）在相同电流条件下，扩散系数小的溶质比扩散系数大的溶质的分离效率高，即扩散引起的峰加宽较小，分离效率较高。这就是HPCE能高效分离生物大分子（如蛋白质、核酸等）的理论依据。
另外，和一般谱一样，分离效率也可直接从电流图求出，即
N=5.54(t/W1/2)2 or N=16(t/W)2
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议