●前⾔
精密输液器2021年11⽉欧易/⿅明⽣物合作客户江苏省南通⼤学神经再⽣重点实验室顾晓松院⼠团队，顾芸教授在Biomaterials期刊发表了题为“BMSC-derived extracellular matrix better optimizes the microenvironment to support nerve regeneration”的研究成果，通过TMT标记蛋⽩组+免疫荧光研究⽅法，发现⾻髓⼲细胞来源的细胞外基质能优化神经细胞再⽣微环境，为周围神经缺损临床修复提供了新的替代⽅案。
中⽂标题：⾻髓⼲细胞来源的细胞外基质能更好地优化⽀持神经再⽣的微环境
研究对象：神经细胞再⽣、细胞外基质
发表期刊：Biomaterials
模糊时间
缓冲垫影响因⼦：12.479
发表时间：2021.11.13
合作单位：南通⼤学江苏省神经再⽣重点实验室
运⽤⽣物技术：TMT标记定量蛋⽩质组学（由欧易/⿅明⽣物提供技术⽀持）
●研究背景
外伤性周围神经损伤是⼀种常见的临床难题，⽬前的⽅法难度⼤、疗效低。鉴于⾃体神经移植供体病变的⾼风险，以及供体组织的来源有限，创造⼀种有前途的组织⼯程神经移植修复缺损神经将是未来临床神经损伤的重要⽅向。 细胞外基质(ECM)是⼀种复杂的、由可溶性和不可溶性分⼦组成的异质⽹络，为细胞和组织的⽣长与
修复提供了天然微环境的物理结构和⽣化环境，越来越多的证据表明，ECM有助于指导细胞⾏为和组织再⽣。基于这⼀认识，ECM神经移植，如⾃然衍⽣的脱细胞组织(也称为组织衍⽣的ECM⽀架)，⽤单个ECM组件修饰的⽀架，以及培养的细胞衍⽣的ECM修饰的组织⼯程材料已经被成功构建。
●研究思路
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●研究结果
1.TMT标记蛋⽩组学分析细胞源的胞外基质和脱细胞神经的蛋⽩质组 图1 | 细胞来源的ecm和脱细胞神经的定量蛋⽩质组学研究
a1：通过质谱鉴定的2302个蛋⽩的Venn；小柳树和小枣树教学设计
a2：PCA图显⽰15个样本之间⽆监督聚类；
a3：所有样品蛋⽩质的热图。显著富集了下调(绿⾊)和上调(红⾊)的细胞⽣物过程(p<0.05)。⽐例尺显⽰表达⽔平(红⾊表⽰上调，绿⾊表⽰下调)；
b1：维恩图⽐较不同组的137个基质蛋⽩成分，直⽅图显⽰了特有或共有的蛋⽩数量。Uniq1分别表⽰SC-ECM、BMSC-ECM、SKP-SC-ECM或成纤维细胞- ecm中的特异性蛋⽩。Uniq2是指脱细胞神经中的特定蛋⽩质。Common指细胞衍⽣的ECM和脱细胞神经共有的蛋⽩；
b2：5种ECM中基质蛋⽩含量。
利⽤TMT标记蛋⽩组学分析⽐较施万细胞（SCs）、成纤维细胞（FBs）、⾻髓间充质⼲细胞（BMSCs）、⽪肤祖细胞分化的施万细胞（SKP-SCs）的ECM和脱细胞神经的蛋⽩质成分，发现五种细胞外基质之间有76个共有蛋⽩质(图1A-a1)。通过聚类分析发现⾻髓间充质⼲细胞（BMSC-ECM）与⼀部分脱细胞神经重叠，表明BMSC-ECM和脱细胞神经之间有相似的蛋⽩质组学图谱(图1A-a2)。研究者通过进⼀步的⽣物信息学分析和MatriSomeDB过滤来⽐较和分析五种细胞外基质的基
质蛋⽩类型和含量的差异，发现BMSC-ECM与脱细胞神经最为相似，因此最终确定BMSC可以作为细胞外基质⽣成的优良亲本细胞。
2.细胞源性细胞外基质和脱细胞神经的结构和特征
免疫染⾊、共聚焦成像及3D结构重建分析并构建了来⾃SCs、FB、BMSCs、SKP-SCs和脱细胞神经的ECM的3D空间结构（图2）。此外，利⽤扫描电⼦显微镜(SEM)和透射电⼦显微镜(TEM)分析揭⽰细胞衍⽣的ECM和脱细胞神经的微结构(纳⽶纤维的结构)。
结合蛋⽩质组学数据和细胞来源的ECM和脱细胞神经的结构特征，研究⼈员认为BMSC-ECM可能更接近于模仿天然神经ECM的组织特异性⽣化和结构属性。
图2 | 免疫染⾊3D、扫描电镜图和投射电镜图
A. ECMs结构与特点ecm的纤维连接蛋⽩(⽩⾊)、层粘连蛋⽩(红⾊)、I型胶原蛋⽩(⾦⾊)、IV型胶原蛋⽩(绿⾊)免疫染⾊3D图像，⽤Imaris软件分析，⽐例尺5µm。
5氟胞嘧啶
B.扫描电镜图(b1)和透射电镜图(b2)显⽰细胞来源的ecm和脱细胞神经的超微结构。⽐例尺，(b1)为5µm， (b2)为1µmb2
3.背根神经节(DRG)体外培养模型评估物种ECMs⽀持神经突⽣长的能⼒
DRGs分别在来源于施万细胞、成纤维细胞、⾻髓间充质⼲细胞和⽪肤祖细胞分化的施万细胞的细胞外基质上培养，以聚赖氨酸包被的载玻⽚上培养为对照。48⼩时后， NF200免疫荧光染⾊测定DRG神经元的⽣长，并⽤层粘连蛋⽩标记细胞外基质。在ECM上培养的从DRGs延伸的神经突起⽐在涂有PLL的载玻⽚上培养的从DRGs延伸的神经突起更长且更分叉，表明ECM显著增强了DRGs的轴突⽣长(图3a和图3b)。
此外，在⾻髓间充质⼲细胞-细胞外基质上培养的DRG神经突起的突起长度和覆盖⾯积⼤于在其他细胞外基质上培养的(图3c)。这⼀结果进⼀步证明，⾻髓间充质⼲细胞可能是⽣成更适于神经再⽣微环境的细胞外基质亲代细胞。
受弯构件挠度图3 | ECM上DRG神经元的轴突⽣长
A. 双免疫荧光显微图显⽰DRGs的轴突⽣长(NF-200，绿⾊)，培养于SC、BMSC、SKP-SC和成纤维细胞衍⽣的ECM(层粘连蛋⽩，红⾊)上，对照为PLL，⽐例尺为500µm；
B. 使⽤相对定量⽅法测量NF阳性神经突起延伸的最⼤距离和分⽀数量。⽐例尺1000µm；
C. 从染⾊观察得到的直⽅图，显⽰从DRGs延伸的轴突长度和⾯积的定量⽐较(n = 5)。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p <
0.001与pll涂层;# # # p < 0.01, p < 0.05, # # # p < 0.001和SC-ECM;Δp < 0.05,ΔΔp < 0.01,ΔΔΔp < 0.001和BMSC-ECM。
4.神经移植物制备
为了证明细胞外基质⽀持体内神经再⽣，开发了基于壳聚糖/丝素蛋⽩的细胞外基质修饰的神经移植物，如⽰意图所⽰(图4a)。基于蛋⽩质定量，将施万细胞、成纤维细胞、⾻髓间充质⼲细胞和⽪肤祖细胞分化的施万细胞按⽐例培养在壳聚糖导管/丝素蛋⽩基神经⽀架上，并⽤维⽣素C刺激14天。接下来，⽤扫描电镜研究去细胞前后细胞在丝素蛋⽩纤维和壳聚糖导管上的粘附和⽣长。我们注意到细胞螺旋缠绕，包裹SF纤维形成并排或端对端的多层细胞链；然⽽，它们的⽣长在壳聚糖导管的外表⾯和
内壁上显⽰出不规则的排列。脱细胞后，细胞外基质的形态学特征显⽰了包裹SF纤维的多层⽹状结构，或者在壳聚糖导管的外壁和内壁上的松散组织的纱布⽹(图4b)。
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