李卫霞
【摘 要】对乙酰胆碱酯酶法的基本原理、类型及其在农药残留检测中的应用进行了概述,并对农药残留检测质量控制过程中存在的问题作了重点讨论.
【期刊名称】《湖南农业科学》
【年(卷),期】2010(000)003
【总页数】4页(P71-73,76)
【关键词】南希奶奶乙酰胆碱酯酶;农药残留;质量控制威廉姆斯
【作 者】李卫霞
【作者单位】重庆三峡学院生物系,重庆,万州,404000
黑客社会工程学攻击
【正文语种】中 文
【中图分类】S481.8
随着工农业生产的迅速发展，环境污染问题日益显著，人们对于食品安全问题也日益关注。我国是农药使用的大国，农药残留的现象普遍存在，然而现有的一些检测方法已无法满足高灵敏度的要求，因此建立一种快速灵敏的农药残留检测方法具有十分重要的意义。酶法操作简单，速度快，不需要昂贵仪器，适应于现场监测和对大规模食品的筛选检测，被广泛用于野外农药残留快速检验。可用于农药残留检测的酶有羧酸酯酶、丁酰胆碱酯酶及乙酰胆碱酯酶，前两种酶受干扰因素多，假阳性率高，专一性低 [1-2]。乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）由于具有较好敏感性及较高的活性，在有机磷和氨基甲酸酯类农药检测中应用广泛。
1 乙酰胆碱酯酶法原理
乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性酶，能够高效水解神经递质乙酰胆碱，保证神经冲动在突触间的正常传导，它的活性受到有机磷或氨基甲酸酯类农药的特异性抑制，故而成为监控有机磷农药的靶酶[3]。乙酰胆碱酯酶催化的反应如下：
HO（CH3）3NCH2CH2OOCCH3（乙酰胆碱）+H2O→HO（CH3）3NCH2CH2OH（胆碱）+CH3COOH
利用这一特性，用滤纸片或电极作为载体，将乙酰胆碱酯酶吸附在上面，加入显剂，如果酶的活性没有被抑制，则生成的产物可以使显剂显，如果被测样品中含有农药残留则酶活性被抑制不能生成水解产物，显剂不显。根据颜的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号的变化，可判断是否存在有机磷及氨基甲酸酯类农药[4]。
2 乙酰胆碱酯酶法分类
酶抑制法依据其特异性抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，破坏神经的正常传导，使昆虫中毒致死的毒理学原理，将乙酰胆碱酯酶与样品反应，根据乙酰胆碱酯酶活性受抑制程度，检测样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药含量。乙酰胆碱酯酶对有机磷农药较敏感，测定的灵敏度高，选择性强。在实际应用中主要包括速测卡、速测仪、生物传感器三种类型。
2.1 速测卡
速测卡即酶抑制试纸法，将从敏感生物体内提取的乙酰胆碱酯酶和乙酞胆碱类似物2，6-二氧靛酚乙酸醋分别固定到滤纸上。如果样品中不含有有机磷或氨基甲酸醋类农药，则靛酚乙酸醋在酶的催化下生成蓝靛酚。当样品中含有有机磷或氨基甲酸醋类农药，乙酞胆碱醋酶则与其结合，失去了催化靛酚乙酸醋的能力。该方法简单实用，即通过肉眼观察卡片的颜确定农残是否超标。这种方法的检出限为 0.3～10.0 mg/kg[5]。
2.2 速测仪
速测仪即酶抑制分光光度法，是将分光光度计进行改装和简化，配上检测试剂（多是将底物、酶、显剂制成三种不同颜的药片），测定方法与常规酶活力测定方法相同，以酶活性抑制率为指标判定是否农残超标。该方法具有较高的可靠性和灵敏性，且操作简单，测定速度快，是目前常用的方法，很适合于水中和市售新鲜蔬菜的农残快速检测，检测限在 0.029～10.0 mg/L[6]。
2.3 生物传感器
复合氨基酸
生物传感器是根据生物敏感部件与特定分析物之间的反应产生的一些物理化学信号的变化，
将其转化后记录下来。检测灵敏度和准确度有了很大的改善，自动化程度和现场检测能力等方面有了较高的提高，检测限可达20 ppb[6]。包括电流型生物传感器和电位型生物传感器，前者的工作原理：底物氯化乙酞硫代胆碱在胆碱醋酶的催化作用下可以水解为乙酸和琉基胆碱，当胆碱醋酶被农药抑制时，氧化电流的大小能准确地反应酶被抑制的程度，从而检测出农药残留的浓度[7]。而电位型传感器则中电位性传感器是将酶反应产生的pH值变化由传感器测出，从而间接测定有机磷农药残留量[6]。
3 乙酰胆碱酯酶法在农残检测中的应用
由于有机磷、氨基甲酸酯类农药使用不当或误食这两类农药残留量超标的蔬菜而引起的中毒现象一直十分严重。使用酶抑制法检测农药残留量从20世纪50年代开始陆续有报道。酶抑制分析法与其它分析方法相比，最大的特点就是它的特异性，分析速度也比较快。
利用酶抑制法比原理生产的各种速测卡、速测仪正逐步进入果蔬生产基地、农贸市场、超市及监督部门，成为我国农药残留快速测定的主流技术。赵建庄[8]用自行研制的便携式农药残留速测仪，对果蔬中农药残留毒性进行快速检测，可以直接显示有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的抑制率，确定农药残留毒性水平。2007年李昕等应用家蝇头部
提出的乙酰胆碱酯酶检测果蔬上10种有机磷和氨基甲酸酯农药，检测灵敏度0.001～0.1 mg/kg范围。与目前国内外使用的同类检测方法相比，如各种速测仪、酶纸片法检测灵敏度一般在0.1～10.0 mg/kg范围，检测灵敏度有显著提高[9]。
乙酰胆碱酯酶法除用于食品及果蔬中农药残留的检测，还可用于检测水体污染状况。宋燕华等[10]用乙酰胆碱酯酶为生物标志物进行钱塘江水环境野生鲫鱼有机磷农药暴露的研究发现，部分地区野生鲫鱼血乙酰胆碱酯酶活性受到抑制，说明水环境中水环境中存在机磷农药的污染。此外，中药材中有机磷和氨基甲酸酯农药残留的测定方法主要有气相谱法，气相谱-质谱法等，这些检测方法需对样品进行分离、提取、衍生化等预处理，耗时，且不适用于现场快速检测。2009年陈安珍等[11]用胆碱酯酶法对中药材中的有机磷和氨基甲酸酯进行检测，最低检出浓度为0.1 μg/mL。
生物传感器是目前农药残留分析技术的研究热点。2003年魏福祥[12]将活化好的硝酸纤维素膜浸入到乙酰胆碱酯酶、戊二醛、牛血清白蛋白的混合液中，采用共价交联法制备出酶片，制备出安培型生物传感器。2008年柳娜等[13]研究发现硫代黄素T与乙酰胆碱酯酶形成超分子复合物，产生了特征荧光峰。而有机磷农药可破坏此复合物使硫代黄素T的特征荧
光峰被猝灭，猝灭强度与对氧磷浓度存在线性关系。若利用此原理制备出检测AChE抑制剂的荧光光纤生物传感器，拥有检测迅速、灵敏度高、线性范围较宽、不需要消耗酶底物和抗干扰能力强等特点，具有较好的应用前景。
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4 质量控制因素
影响酶抑制法检测效果的因素很多，与酶源、有机磷农药类型检测系统等均有关系，从而造成检出限相差较大。源自不同物种或取自一个生物体的不同组织的一种酶，其活性测定的最适条件经常会变化，影响条件通常包括最适 pH值、酶促反应时间及温度及抑制剂等方面[14]。
4.1 酶源中国商检局
酶抑制法常用的酶源有：植物酶、牛、猪等家畜的肝脏酯酶、人血浆或血清、马血清、蝇或蜜蜂头部的脑酯酶、兔或鼠的羧酸酯酶等[15]。但不同种类、不同来源的酶源对检测灵敏度具有较大的影响。1996年余孝颖等[16]研究发现，家蝇头部乙酰胆碱酯酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感度要优于其他来源的胆碱酯酶。从昆虫组织中提取的乙酰胆碱酯
酶粗酶液中除了含乙酰胆碱酯酶外，还有其他多种酶类的存在，会显著影响到酶的特性，其中一些酶是解毒酶，能够催化水解农药，也有些酯酶能够作为乙酰胆碱酯酶的替代靶标，起到保护乙酰胆碱酯酶的作用。实验中如果用分离纯化后的酶液作为乙酰胆碱酯酶源来测定酶的动力学特性和抗抑制性，则能避免这些问题[17]。
此外在淡水鱼及海洋鱼类中也可以提取胆碱酯酶，淡水鱼中首鱼科中的大黄鱼、小黄鱼、黄姑鱼、白姑鱼肌肉中的胆碱酯酶对有机磷化合物相当灵敏，除小黄鱼酶液比活较低外，其余3种鱼的酶溶液比活基本相同[9]。2008年邱朝坤等[18]研究发现鲫鱼不同组织中乙酰胆碱酯酶活性存在很大差异，鱼脑酶活为35.242 μmol/min·g，肝脏酶活为4.826 μmol/min·g，肌肉酶活为 26.018 μmol/min·g。
4.2 酶的固定化
乙酰胆碱酯酶的固定化技术在酶抑制显法、检测农药残留及生物传感技术的开发中受到广泛的关注[19]。目前应用较为广泛的固定化技术主要有吸附法、交联法、电聚合法等[20-21]。2007年王烨等[22]研究发现，以壳聚糖为载体，吸附-交联法制备乙酰胆碱酯酶膜，经检测固定化酶Km较游离酶的Km降低，最适pH值升高。乙酰胆碱酯酶在固定化后稳定性
得到了较大的提高，这是由于固定化增加了酶构象的牢固程度、挡住了不利因素对酶的侵袭或限制了酶分子间的相互作用，使得酶的稳定性有了显著的提高，酶膜的实际应用性能较游离酶有了较大的改善。
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