谷胱甘肽-二茂铁的合成及其与牛血清白蛋白的相互作用
王芳斌
彭
勇
范美意
刘又年*
黄可龙*
(中南大学化学化工学院，长沙410083)
摘要：采用液相合成法，以O -苯并三唑-N ,N ,N ′,N ′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和1-羟基苯并三氮唑(HOBT)为缩合剂，将二茂铁胺和还原型谷胱甘肽(GSH)反应，合成了具有电化学活性的谷胱甘肽-二茂铁(GSH -Fc)，其收率为23.2%，并对目标产物进行了红外、核磁、质谱表征.通过电化学方法研究了GSH -Fc 与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用特性.电化学实验结果表明,BSA 和GSH -Fc 结合位点位于BSA 的亚结构域IIA，结合常数为1.71×106L ·mol -1，结合位点数为1.30.同时通过荧光光谱法研究了GSH -Fc 与BSA 相互作用是一种静态猝灭的过程，结合常数和结合位点数分别为2.74×106L ·mol -1和1.57，与电化学方法得到的结果相吻合.关键词：谷胱甘肽-二茂铁；牛血清白蛋白; 相互作用;
电化学;
荧光光谱
中图分类号：O641
Synthesis of Glutathionyl Ferrocene and Its Interaction with
Bovine Serum Albumin
WANG Fang -Bin
PENG Yong
FAN Mei -Yi
LIU You -Nian *
HUANG Ke -Long *
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Central South University,Changsha 410083,P.R.China )Abstract ：Glutathionyl ferrocene (GSH -Fc)was synthesized from glutathione and ferrocenyl amine using O -(benzotriazol -yl)-N ,N ,N ′,N ′-tetramethyluronium (HBTU)/1-hydroxybenzotrizole (HOBT)as coupling agents in solution with a yield of 23.2%.The compound was characterized by 1H -NMR,IR and MS.Interactions of bovine serum albumin (BSA)with glutathionyl ferrocene were investigated by electrochemical methods.Experimental results revealed that there were specific interactions between BSA and GSH -Fc at the IIA subdomain.The binding constant and binding sites were obtained by linear sweep voltammetry and had values of 1.71×106L ·mol -1and 1.30,respectively.Fluorescence spectroscopy methods were employed to investigate the interaction between GSH -Fc and BSA as well.Results showed that the fluorescence of BSA was quenched by GSH -Fc during a static quenching process.The binding constant and the number of binding sites were obtained and had values of 2.74×106L ·mol -1and 1.57,respectively,which agreed well with results from electrochemical experiments.Key Words ：Glutathionyl ferrocene;
BSA;
Interaction;
Electrochemistry;
Fluorescence spectroscopy
[Article]
www.whxb.pku.edu
物理化学学报(Wuli Huaxue Xuebao )
Acta Phys.-Chim.Sin .,2009,25(6)：1125-1130
Received:January 19,2009;Revised:February 24,2009;Published on Web:March 31,2009.
*
Corresponding authors.Email:liuyoun@mail.csu.edu,klhuang@mail.csu.edu;Tel:+86731-8836964.国家自然科学基金(20676153,20876179)资助项目
鬁Editorial office of Acta Physico -Chimica Sinica
生物分子的识别及相互作用是生命的基础，研究和分析生物分子识别、相互作用机理及分子结构和功能之间的关系是阐明生命活动规律的关键，尤其是研究小分子与蛋白质的相互作用在生命活动的研究中具有重要意义.谷胱甘肽是生物活性肽，广泛存在于生物体内，对生物的生理活动起着重要的作
用[1].血清白蛋白(SA)是人体及动物体内最重要的蛋白之一，在体内主要起着小分子、药物分子、有机化合物及其他代谢物的运输和代谢作用，可以和许多内、外源物质广泛结合，在维持体液的正常分布、保持血容量及血压等方面起着重要作用.牛血清白蛋白(BSA)与人血清白蛋白(HSA)具有类似的结构
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Acta Phys.-Chim.Sin.,2009
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和功能，也是目前研究最多的血清白蛋白[2,3].因此，研究BSA 与GSH 的相互作用对诠释小分子与蛋白质的相互作用有着重要的意义.
电化学方法具有快速、灵敏、简单的特点，近年来，在生物分析领域得到了长足的进步[4].但是大多数多肽或蛋白质没有电化学活性，限制了这种方法的应用.通常将具有电化学活性的分子链接在多肽、蛋陈火军>银蒿
白质或DNA 上，使其具有电化学活性.二茂铁具有良好的电化学特性和独特的夹心型结构，且易与多肽、蛋白质和DNA 等生物分子发生共轭反应，因此，常被用来作为生物电化学探针[5-9].特别是二茂铁-多肽化合物，近年来在蛋白质分子的识别[10]、离
子的检测[11,12]、
特定序列DNA 片断的分析[13-15]等领域取得了很大的进展.
针对谷胱甘肽不具有电化学活性这一缺陷，本研究将电化学活性的二茂铁与其结合，通过电化学方法研究GSH 与蛋白质的相互作用，并辅以荧光光谱方法对结果进行了验证.研究结果为谷胱甘肽-二茂铁这种新型的电化学探针的研发提供有关参数.
1
实验部分
1.1
试剂与仪器
牛血清白蛋白(BSA)，还原型谷胱甘肽(GSH，纯度>98%),N -羟基琥珀酰亚胺(NHS)，巯基十一酸(MUA),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾购自Sigma 公司；三乙胺(Et 3N),O -苯并三唑-N ,N ,N ′,N ′-四甲基脲六氟
磷酸酯(HBTU),1-羟基苯并三氮唑(HOBT)和二碳酸二叔丁酯(Boc 酸酐)购自上海生工生物工程技术有限公司；二茂铁，叠氮化钠购自上海金山化工有限公司；氯甲酸乙酯购自湖南师范大学化学试剂厂；其他有机试剂均为分析纯试剂，所用水均为二次蒸馏水.INOVA -400核磁共振仪(美国Varian 公司);AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet 公司);LCQ Advantage 离子阱质谱仪(美国菲尼根公司);CHI660B 电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);F -2500荧光分光光度计(日本日立公司).1.2实验步骤
1.2.1二茂铁胺及谷胱甘肽-二茂铁合成
参考Rapic 等[16]以二茂铁为原料合成二茂铁二甲酸的方法，采用二茂铁为原料，合成了二茂铁单甲酸.然后，以二茂铁单甲酸为原料，依照我们研究的
合成方法[17]，合成二茂铁胺，并将其与GSH 反应，合成了谷胱甘肽-二茂铁(GSH -Fc)，其合成路线见图1.
称取3.0g 二茂铁甲酸(化合物1)溶于3mL 水和10mL 丙酮的混合溶液中，冷却至0℃后，滴加2.1mL 三乙胺和36mL 丙酮组成的溶液，再加入1.16mL 氯甲酸乙酯和6.6mL 丙酮的混合溶液.搅拌30min，将1.32g NaN 3溶于4.8mL 水后滴入反应体系.反应结束后，将溶液倒入过量的冰水中，用CH 2Cl 2萃取，将有机相蒸干后得到红褐晶体叠氮羰基二茂铁1.1g(化合物2). 将50mL 叔丁醇加至圆底烧瓶中，搅拌，加入0.97g 化合物2，加热至80℃回流反应1.5h.反应
图1谷胱甘肽-二茂铁(GSH -Fc)的合成
Fig.1Synthesis of gluthione -ferrocene(GSH -Fc)
Et 3N:triethyl amine,t -BuOH:tert -butanol,(Boc)2O:anhydride di -tert -butyl pyrocarbonate,HBTU:O -(benzotriazol -yl)-N ,N ,N ′,N ′-tetramethyluronium,HOBT:1-hydroxybenzotrizole
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No.6王芳斌等：谷胱甘肽-二茂铁的合成及其与牛血清白蛋白的相互作用
完毕后取出溶液蒸干，用柱层析法进行纯化，展开剂二氯甲烷/己烷/乙酸乙酯的体积比为8∶1∶5，得橘红固体叔丁基氧-氨基二茂铁0.73g(化合物3).
将0.43g化合物3溶于乙酸乙酯溶液中，然后在0℃通干燥的HCl气体1h，再在室温下反应0.5 h，最后蒸干得到红褐的二茂铁胺固体0.27g(化合物4).
取0.76g NaHCO3于圆底烧瓶中，在5℃下用蒸馏水溶解得NaHCO3的饱和溶液，另外取0.48g (Boc)2O，将其溶解于大约30mL二氧六环中，将上述两种溶液混合；然后称0.614g GSH加入以上混合液.反应12h后，用乙酸乙酯萃取，取油相，用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干即可得到白晶体0.53g (化合物5).
取0.32g化合物5于干燥的圆底烧瓶中，用无水CH2Cl2溶解.在0℃下加入1.0mL Et3N，再加入0.42g HBTU和0.11g HOBT.反应1h后，加入0.30g化合物4,1.0mL Et3N，反应2h后移入室温反应12h.反应完毕后，依次用NaHCO3饱和溶液, 0.5mol·L-1的盐酸,NaHCO3饱和溶液和水萃取；用无水硫酸钠干燥油相，过滤，蒸干，用柱层析法对粗产物进行纯化，以CH2Cl2/EtOAc/MeOH体积比为30∶10∶1的混合溶剂为展开剂，得0.34g黄的目标产物6，其收率为23.2%.1H-NMR(δ):6.78(brs, H,NH),6.23(brs,2H,NH),4.62(s,2H;H-2′,H-5′, Fc),4.49(s,5H;Fc unsubst),4.20(s,2H;H-3′,H-4′,Fc), 1.96(d,9H,CH3),1.65(s,3H).IR(cm-1,MeOH):3436 (—NH),2851(—SH),1653(C襒O),1021(C—O—C); MS(EI),m/z:590.5[M+H]+.
用0.05μm的Al2O3抛光裸金电极，二次水清洗，超声，用氮气吹干.将干净的金电极浸泡在4.0mmol·L-1MUA(11-巯基十一烷酸)的乙醇溶液中，密封，室温下静置18h，取出，先用乙醇溶液冲洗，再用水冲洗, N2吹干.在MUA修饰后的金电极表面滴加含有5.0 mmol·L-1EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳酰二亚胺)和5.0mmol·L-1NHS的磷酸缓冲溶液(PBS)，反应1h后，用二次蒸馏水清洗电极,N2吹干后再与5.0mmol·L-1的牛血清蛋白反应4h得到MUA-BSA修饰电极，以备电化学测试.
1.2.3电化学实验
以金电极或修饰电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，测试循环伏安(CV)特性.测定前电解池通入10min N2除氧，扫描速率0.1V·s-1.
1.2.4荧光光谱实验
将BSA溶于PBS缓冲溶液中，固定BSA浓度为50μmol·L-1，改变GSH-Fc浓度，以PBS缓冲溶液定容，静置30min.激发波长λex=280nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5nm，扫描速率为300nm·min-1，在290-450nm范围内测定并记录荧光发射光谱.
2结果与讨论
2.1电化学方法
2.1.1MUA-BSA修饰电极
在扫描速率为0.1V·s-1，支持电解液为0.1mol·L-1的KClO4的PBS(pH=7.4)溶液中,MUA-BSA修饰电极在-0.2-0.6V内没有出现氧化还原峰(图2曲线a)，而在0.1mol·L-1GSH-Fc溶液中，在-0.2-0.6V范围内出现一对氧化还原峰,E pa=0.213V,E pc= 0.150V,ΔE=0.063V,I pc/I pa=1.038(见图2曲线c)，该氧化还原峰是由GSH-Fc中二茂铁基团发生氧化还原而产生的.但是MUA-BSA修饰电极在0.1mol·L-1二茂铁甲酸溶液的CV曲线如图2曲线b所示，表明二茂铁与BSA没有相互作用.由上述可知，由于GSH与BSA具有相互作用，二茂铁基团的电子才能通过MUA-BSA修饰电极进行电子的转移.同时研究了MUA-BSA修饰电极在GSH-Fc溶液中峰电流与扫描速率的关系，结果表明，峰电流与扫描速率的平方根(v1/2)呈线性关系，该电极反应受扩散步骤控制.
图2MUA-BSA修饰电极在不同溶液中的循环伏安曲线Fig.2Cyclic voltammetry curves of MUA-BSA modified electrode in different solutions
(a)0.1mol·L-1PBS(phosphate-buffered saline),(b)0.1mol·L-1
动脉mvFc-COOH,(c)0.1mol·L-1GSH-Fc
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2.1.2电化学测定GSH-Fc与BSA的结合位点
BSA具有两个高亲合结合位点亚结构域IIA 和亚结构域IIIA，而华法林(warfarin)和布洛芬(ibuprofen)分别与亚结构域IIA和亚结构域IIIA有高结合性[18]，同时BSA还有一个游离的巯基，而碘代乙酰胺常用来封闭-SH[19].因此为了研究BSA与GSH的结合位点，将MUA-BSA修饰电极浸泡在华法林、布洛芬和碘代乙酰胺溶液中，分别用来封闭BSA的亚结构域IIA、亚结构域IIIA和-SH，然后将处理的电极在GSH-Fc溶液中测得的CV曲线如图3所示.由图可知，布洛芬和碘代乙酰胺封闭后的BSA修饰电极电化学行为未发生变化，而经华法林封闭后，该修饰电极在GSH-Fc溶液中的氧化还原峰在-0.2-0.6V内消失，由此可知,GSH-Fc和华法林与BSA的相互作用在同一个结合位点，位于亚结构域IIA.
2.1.3电化学法测定GSH-Fc与BSA的结合参数
在GSH-Fc溶液中加入BSA，阳极峰电流降低.参考Li等[20]的方法，假设BSA有n个相同且独立的结合位点，与GSH-Fc形成化合物BSA-n GSH-Fc，即:
BSA+n GSH-Fc葑BSA-n GSH-Fc(1)条件平衡常数e100vs
K=c(BSA-n GSH-Fc)/[(c(GSH-Fc))n×c(BSA)](2)因为,
c0(BSA)=c(BSA)+c(BSA-n GSH-Fc)(3)ΔI max=kc BSA(4)ΔI=kc(BSA-n GSH-Fc)(5)所以,
lg[ΔI/(ΔI max-ΔI)]=lg K+n lg[GSH-Fc](6)ΔI为GSH-Fc溶液与其加到BSA溶液中的阳极峰电流强度差值,ΔI max为ΔI的最大值.
固定BSA的浓度为20μmol·L-1，逐渐改变GSH-Fc的浓度，用线性扫描伏安法(LSV)测得阳极峰电流与GSH-Fc浓度关系如图4A所示.由图可以看出,GSH-Fc溶液阳极峰电流强度以及GSH-Fc与BSA混合后阳极峰电流强度都与GSH-Fc浓度成正比.当GSH-Fc浓度低于35μmol·L-1时,ΔI与GSH-Fc浓度具有较好的线性关系，但是当GSH-Fc 浓度高于30μmol·L-1时,ΔI趋向稳定.由图4B中lg[ΔI/(ΔI max-ΔI)]和lg[GSH-Fc]的线性关系可以得到GSH-Fc与BSA的结合常数(条件平衡常数)K为1.71×106L·mol-1，结合位点数n为1.30.
图3GSH-Fc在封闭后的MUA-BSA修饰电极上的
循环伏安曲线
Fig.3Cyclic voltammetry curves of GSH-Fc at the
modified electrode of blocked MUA-BSA
(a)iodoacetamide,(b)ibuprofen,(c)warfarin
图4GSH-Fc溶液中加入20μmol·L-1BSA前(a)后(b)阳极峰电流及其变化量(c)与GSH-Fc浓度关系(A)及
lg[ΔI/(ΔI max-ΔI)]与lg[GSH-Fc]的线性拟合(B)
Fig.4GSH-Fc anodic peak currents vs GSH-Fc concentration in the absence(a)and presence(b)of20μmol·L-1 BSA and the difference(c)between curves a and b(A),and the plot of lg[ΔI/(ΔI max-ΔI)]vs lg[GSH-Fc](B) 1128
No.6王芳斌等：谷胱甘肽-二茂铁的合成及其与牛血清白蛋白的相互作用
2.2荧光光谱方法测定GSH-Fc与BSA反应的
结合常数和结合位点数
固定BSA的浓度为50μmol·L-1，逐渐增加GSH-Fc溶液浓度，测量体系荧光发射光谱，如图5A 所示.由图可知，随着GSH-Fc浓度的增大,BSA荧光强度逐渐降低，因此GSH-Fc对BSA具有荧光猝灭作用.
根据Stern-Volmer方程[21],冷阴极管
F0
F
=1+k qτ0[Q]=1+K SV[Q](7)式中,F0和F分别为未加猝灭剂时的荧光强度和加入猝灭剂后的荧光强度,[Q]为猝灭剂浓度,τ0为猝灭剂不存在时荧光分子平均寿命,k q为动态荧光猝灭速率常数,K SV为Stern-Volmer动态猝灭常数.由方程(7)可得k q=2.2×1012，远远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数2.0×1010L·mol-1·s-1这一数值[22]；因此可以确定GSH-Fc对BSA荧光猝灭过程不是由扩散控制的动态猝灭过程，而是一种静态猝灭的过程.
静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发荧光的配合物，从而导致荧光物质荧光强度降低的过程[23].荧光体与静态猝灭剂Q间的猝灭反应可表示为[24]
lg F0-F
2013广东高考语文作文F
=lg K0+n lg[Q](8)式中K0为结合常数,n为结合位点数.以lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作线性拟合，得到其线性相关系数为0.997，线性拟合方程为
lg F0-F=6.439+1.57lg[Q](9)
通过计算得到GSH-Fc与BSA反应的结合常数K0= 2.74×106L·mol-1，结合位点数n=1.57.
3结论
采用液相合成法，合成了具有电化学活性的GSH-Fc.通过电化学方法研究了GSH-Fc与BSA之间的相互作用.BSA和GSH-Fc结合位点位于BSA 的亚结构域IIA，结合常数为1.71×106L·mol-1，结合位点数为1.30.同时通过荧光光谱法验证了这种相互作用，结果表明,GSH-Fc与BSA相互作用是一种静态猝灭的过程，结合常数和结合位点数分别为2.74×106L·mol-1和1.57.与电化学方法得到的结果相吻合.GSH-Fc可作为电化学探针用于研究谷胱甘肽分子与蛋白质(酶)、DNA等生物分子的相互作用，相关工作正在进行中.
References
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6Zhang,R.;Wang,Z.;Wu,Y.;Fu,H.;Yao,J.Org.Lett.,2008,10:
图5不同GSH-Fc浓度时BSA的荧光猝灭光谱图(A)及(F0-F)/F与GSH-Fc浓度关系(B)
Fig.5Fluorescence emission spectra of BSA in the presence of different concentrations of GSH-Fc(A)and
the plot of(F0-F)/F vs[GSH-Fc](B)
F0and F are the relative fluorescence intensities before and after the addition of GSH-Fc to the BSA solutions.
[GSH-Fc]/(μmol·L-1):a)0,b)20,c)40,d)60,e)80,f)100,g)120,h)140,i)160,j)180
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