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利用微生物处理秸秆的工艺研究陈漫 20

微生物实验

姓名：陈漫学号：06092813 班级：生工09-1

实验名称：利用微生物处理秸秆的工艺研究

实验日期：2011年12月21日~2011年12月30日（周期10天）

实验组员：秦晋、廖祥、宋遥、肖铁成、朱维康、陈漫、吴菡、黄舒雅

实验设计综述：

一、处理对象：秸秆（秸秆的生物结构）

我们小组使用的为玉米秸秆,玉米秸秆性状如下。

表1 玉米秸秆的化学成分含量表

主要化学成分	纤维素	半纤维素	木质素	蛋白质
含量百分比	38%	25%	25%	4%~6%

从秸秆的组成结构来看，纤维素是秸秆细胞壁的主要成分，也是秸秆的支持组织。纤维素是纤维二糖的高聚体，为直链扁带状分子结构，无分支。由于葡萄糖单位间依靠，β一1，4一糖苷键相互作用，不能卷成螺旋状，纤维素分子链之间可以利用分子间氢键牢固地相互联接在一起，形成不溶于水的高分子。半纤维素是与纤维素、木质素共存于植物细胞壁中的一大类多糖，主要是木糖、阿拉伯糖、葡萄糖等单糖的聚合体，各自以共价键、氢键、酯键、醚键等相互作用，形成稳定的化学结构。

木质素基本上是由苯丙烷基单元(C6一C3)经C—C键和C—O键相互连接和无规则偶合而成的，是具有三维空间结构的复杂无定型非晶体高聚物，其中有4％的酸溶木质素，其余的成分极难被降解。秸秆中的木质素分子通过酯键与纤维素、半纤维素分子相结合，使三者牢固地缠裹在一起，这种结构使得玉米秸秆坚硬而且难于被降解，导致秸秆生物资源很难作为反刍动物饲料的直接碳源或能源被吸收，难以充分利用。

二、菌的研究：

我们小组选用产甲烷菌，产甲烷菌性能如下。

产甲烷菌的分离大多数来自以下三种环境：

1、水沉积物、沼泽、苔原、稻田、腐败的树木心材及厌氧污泥消化器

2、瘤胃、盲肠和肠

3、地热温泉、洋脊、热液喷口和非洲的基伍湖

产甲烷均是一类能够将无机/有机化合物经过厌氧发酵转化成为甲烷、CO2的严格发酵过程，产甲烷菌是一类水生古生菌，其细胞壁内含有假肽聚糖，可以用溶菌酶/青霉素来筛选得到纯种。

4、产甲烷菌：厌氧产甲烷菌（枯草芽胞杆菌12. 1% ，克鲁斯假丝酵母10%，地衣芽胞杆菌27. 2% 、变栓菌10. 6% 、黄孢原毛平革菌40%）

三、厌氧发酵过程和发酵条件：

① 微量元素对沼气发酵有促进作用，如铁、锌、钴铜等

② 产甲烷发酵的最适条件：pH:6 ~ 8 ,温度：30 ~35℃, TS%：6% ~ 12%, 接种量：5% ~ 15%

四、厌氧发酵的三大技术：

1、厌氧手套箱、

2、厌氧发酵罐、

3、亨盖特滚管技术、

五、发酵底物的处理：

主要化学成分	纤维素	半纤维素	木质素	蛋白质
短信写手含量百分比	38%	25%	25%	4%~6%

我们在发酵过程中能运用的底物多数为纤维素、半纤维素，但是在玉米秸秆中还含有25%的木质素，而木质素在厌氧发酵中不能被降解，所以要对发酵残渣进行在处理。

木质素的处理有物理法、化学法、生物法。

由于物理法和化学法处理过程中耗能较高，且易污染环境，所以现在大多数都使用生物法

处理。

利用放线菌降解木质素：链霉菌假单胞杆菌、巨大芽孢杆菌。

实验创新点：

1 产甲烷菌的分离纯化培养及其培养基对于菌株的选择作用

2 利用PB实验确定最优工艺条件

3 利用微生物的互生关系和协同作用

4 在发酵液上用一层油或其他小密度溶液将其液封

5 利用活动量筒法对气体进行收集

6 反应底物可进行二次降解提高原料利用率

实验方案：

1 、实验目的：

1. 产甲烷菌7684筛选、分离和纯化、

2．研究产甲烷菌的产气机理进行，包括：pH、温度、接种量/%及TS/%(底物固体浓度)产气条件、

3. 利用限制性培养技术，研究产甲烷菌的产气最适条件、

4. 对初始条件产气速率作图分析，得到最适条件、

5. 利用最适条件做正交实验，作出实验数据正交图，分析实验数据方言翻译，到厌氧产气复合最优条件。

（二）、实验仪器和试剂：

① 仪器：100ml量筒一个、500ml量筒一个、恒温水浴锅（35℃）一个、止水阀、厌氧发酵瓶（厌氧培养装置）、玻璃管导管若干、橡胶导管若干、单孔橡皮塞、计算机（用于数据处理）、排水集气装置、粉碎机（用于玉米秸秆的粉碎）

② 试剂：玉米秸秆、氯化铵、菌种原液（工厂废弃液）

装置1：秸秆粉 Ts 40g ,加入1LTs 为15g 活性污泥（4%）。

装置2：秸秆粉 Ts 20g ,加入1LTs为15g 的活性污泥（4%）

装置3：秸秆粉 Ts 20g ,加入NH4Cl 70mg/L ,再加入1LTs为15g 的活性污泥（4%）。

装置图克疣淋③：

（三）、实验步骤：

1. 配置液体培养基，利用湿热灭菌法对培养基进行灭菌

2. 在厌氧手套箱中进行菌种的接种（扩大培养和接种实验）

3. 进行PB实验：

（1宋照肃）对底物浓度(8%)、pH 、接种量(10%)进行控制，对温度进行PB实验：20℃ 、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，记录产气率，并做出实验图。

（2）对底物浓度(8%) 、温度、接种量(10%)进行控制，对pH进行PB实验：6.0、6.5、7.0、7.5 、8.0 ，记录产气率。

（3）对pH、温度、接种量(10%)进行控制，对底物浓度进行PB实验： TS/%(6%、8%、10%和12%)，记录产气率，并做出实验图。

（4）对pH、温度、底物含量(8%)进行控制，对接种量进行PB实验：接种量/%(5%、10%和15%），记录产气率。

（四）、实验数据记录和处理：

装置一数据记录表格：（下图）

时间/h	12	24	36	48	60	72	84	96	108
产气量/ml	586	275	360	479	260	520	295	55 疯狂英语原声版	280

时间/h	120	132	144	156	168	180	192	204	216
产气/ml	204	148	210	160	101	0	16	59	14

40g/无氯化铵是的曲线（温度为35℃）：

装置二和三数据记录表格：（下图）

时间/h	12	24	36	48	60	72	84	96	108
装置1	463	287	297	283	248	210	205	246	288
装置2	455	229	258	265	295	305	278	390	330

时间/h	120	132	144	156	168	180	192	204	206
装置1	294	238	230	263	208	212	188	205	203
装置2	332	295	305	320	295	196	188	165	116

20g/无氯化铵是与20g/加氯化铵的对比曲线（温度为35℃）：

20g/无氯化铵是与40g/无氯化铵的对比曲线（温度为35℃）：

（五）、实验结论及讨论：

一、结论：由实验数据及综合分析，我们不难得出一些规律性的结果，实验在初始阶段，甲烷产量比较高，产气速率高，此时期约为实验开始至5~7天左右，到了后期产气量有所减少。

① 对比20g/无氯化铵是与20g/加氯化铵的对比曲线（温度为35℃），我们可以知道两者在84h是产气都会有所下降，而且加有氯化铵的下降的比较明显，在60~168小时之间，加氯

化铵的产气率高于没有加氯化铵的，证明了氯化铵的加入有利于产甲烷菌的活性，而之后无氯化铵的产气率会高于有氯化铵的，是由于底物的消耗而出现的现状。

② 对比20g/无氯化铵是与40g/无氯化铵的对比曲线（温度为35℃），我们可以看出底物为40g时，菌不稳定，而且产气速率也没有稳定的变化，但我们可以知道，在接种前期，由于接种量的不同对产甲烷菌的产气率也有较大的影响，而且底物的消耗也会较多。但40g时后期180h时的产气为0，我觉得是在操作中出现了问题。

③ 在35℃ TS含量为20g并加有氯化铵是对产甲烷菌的影响较大，而且20g并不是产甲烷菌的最适底物浓度，但氯化铵对甲烷菌的产气会有一定的影响。

二、讨论：由于时间的关系，原定的实验计划有所锐减，之前是计划好了在pH，温度，接种量，TS量等诸多因素下实验，将所有数据通过PB正交实验来选择最优因素，之后据时间有限，我们只做了两组变量，并同时在最适的温度下实验。实验过程中组员们合作愉快，分工明确。逐渐的学会以及掌握了一些研究性实验的操作思路及方法论。通过与实验相关优秀论文的检索，收益颇深。

（六）、实验心得

通过本次试验在观察和总结的基础上，深入思考了影响秸秆产气速率的因素总结如下：

1、原料的碳氮比：利用微生物降解秸秆需要保证微生物的生长条件，而原料碳氮比直接影响微生物的生长状况。

2、质优足量的菌种：为了达到更好的效果，可以在发酵是按1‰添加沼气发酵助剂沼气发酵助剂含有甲烷菌生长繁殖所需的营养物质和微量元素，利用其中的微量元素有效刺激甲烷菌，促使其快速繁殖；同时提高酶的活性和加快酶的反应速度，加速纤维素等大分子化合物的降解、分解过程；利用产品中所添加的菌种繁殖所必须的营养素，更好的使菌种生长。

3、严格的厌氧环境：产甲烷菌是一种厌氧性细菌，对氧特别敏感，它们在生长、发育、繁殖、代谢等生命活动中都不需要空气，空气中的氧气会使其生命活动受到抑制，甚至死亡。产甲烷菌只能在严格厌氧的环境中才能生长。

4、适宜的发酵温度、酸碱度、发酵浓度等。

参考文献：