牛宝珍，杜 民，刘艳红，等.
巨线粒体DNA ND6基因克隆及多态性分析[J ].江苏农业科学,2016,44(4):62-65. doi :10.15889/j.issn.1002-1302.2016.04.016
巨线粒体DNA ND6基因克隆及多态性分析
牛宝珍，杜 民，刘艳红，白 莉，艾家灵
(红河学院生命科学与技术学院/云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自661199)
摘要：利用GenBank
数据库中
欧 亨利
科鱼线粒体ND6基因序列保守区设计引物，采用PCR 技术克隆并测序，共得到 12尾巨ND6基因全序列㊂用DNAMAN 5.0软件比对序列,MEGA 5.0软件分析
科不同鱼类的进化关系，结果表
明：巨
ND6基因序列全长为516bp，碱基含量分别为14.20%㊁34.50%㊁40.20%㊁11.00%，其中 A +T 含量
(54.40%)高于 G +C 含量(45.50%)，存在4个单倍型，发生3次颠换;12个个体4个单倍型间的平均相对遗传距离为0.003；将巨与其他14种鱼类的ND6基因用Neighbore -Joining(NJ)法构建系统发育树，发现巨
单独聚为1
支㊂研究将为今后鱼类线粒体基因组的研究提供科学依据㊂ 关键词:
巨
；线粒体;ND6基因；多态性；系统进化
中图分类号:S917.4 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2016)04-0062-04收稿日期:2015-11-12
基金项目：国家自然科学基金(编号:31360638)；云南省中青年学术带头人后备人才项目(编号:2015HB059)；云南省教育厅科学研究基金重大专项(编号:ZD2013009)；红河学院中青年学术带头人后备人才项目(编号:2014HB0203)；红河学院博士专项(编号:14bs11)㊂
作者简介：牛宝珍(1979 )，女，湖北枣阳人，硕士研究生，实验员，主要从事水生生物资源研究㊂E -mail:niu2011bao@126㊂通信作者：杜 民，博士，副教授，主要从事水生生物技术与资源研究㊂E -mail:du2005min@126㊂
巨
(Bagarius yarrelli Sykes)是云南省特有鱼类，主要分
布于元江㊁澜沧江㊁怒江流域，属于鲇形目(Siluriforme)科
(Sisoridae)
属(Bagarius )㊂
巨
个体很大，体质量约
50kg，全身无鳞，皮肤表面布满细密的微小颗粒物，使其皮肤极为粗糙，此外其体表无黏液，身体背面颜为灰黄，腹面为白，肌肉为黄，所以又称 黄鱼 [1]㊂
巨为底栖肉食
性鱼类，具有口宽㊁上下颌都有齿带㊁牙齿呈锥形且排列紧密㊁鳃耙粗短㊁胃大㊁肠短等特点，主要食物为鱼类㊁虾㊁泥鳅㊁水生昆虫[2]㊂
田树魁等通过比较巨
㊁叉尾鲇㊁
斑点叉尾
3种鱼肌肉中常规营养成分和氨基酸含量，发现巨
肌肉中蛋白
质㊁粗脂肪和必需氨基酸的含量比常规鱼类高，是一种具有较高营养价值的有待驯养开发的野生鱼类[3]㊂杜民等研究表明,
野生巨
具有较高的遗传多样性[4]㊂但是由于地理环境
的改变和人为因素的影响，野生可利用的巨资源越来越少㊂为了保护该鱼类,
薛晨江等开展了巨的人工驯养，并
取得初步成功[5]㊂
鱼类线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是细胞核外(细胞质中)具有转录㊁自主复制和翻译能力的共价闭合环状双链DNA [6]㊂鱼类的mtDNA 主要包括37个基因(22个tRNA 编码基因㊁13个疏水蛋白基因㊁2个rRNA 基因)；其中13个疏水蛋白基因编码的多肽中包含了7个氢化辅酶Ⅰ(nic-otinamide adenine diuncleotide hydrogen,NADH)脱氢酶的亚单位(ND1㊁ND2㊁ND3㊁ND4㊁ND4L㊁ND5㊁ND6)㊂ND6蛋白编码基
因位于L 链上，处于细胞素b 与ND4之间的连续区域，是线粒体内膜呼吸链的重要组成成分[7]㊂在氢化辅酶中，由于ND6基因序列不易发生变异，进化速度一般，且基因片段不长，因此常用来研究物种的遗传多样性㊁种之间的亲缘关系以及系统进化关系[8]㊂方月琴等用复合扩增体系，选择线粒体ND6基因进行种属鉴定，结果表明，该方法可以将13种不同的动物区分开来[9]㊂也有研究表明,ND6基因与人类疾病帕金森氏症等发生有关[10],ND6基因还被用于研究鸟类的亲缘关系[11],
但是大多应用于鱼类体和亚种间的遗传变异研究[12-13]㊂对巨
的线粒体ND6基因全序列进行检测分析，进而分析巨遗传结构㊁变异及与其他物种之间的同源差异,
可为今后巨鱼种研究提供一定的试验数据与理论依据㊂1 材料与方法1.1 试验材料
本研究采用的12
尾巨采自云南省河口县㊂剪取肌肉
组织放于1.5mL EP 管中，贴上对应标签，再加入无水乙醇，于4ħ保存备用㊂
1.2 试验方法1.
2.1 基因组DNA 的提取及多态性引物筛选 DNA 的提取参考Sambrook 等的酚/氯仿抽提法[14]㊂用凝胶成像系统观察㊁照相记录后，将提取的DNA 贮存在-20ħ冰箱中备用㊂
根据GenBank
数据库中已公布的
科巨
鱼线粒体基
因组ND6基因序列(登录号:NC 021606,JQ026260)，用Primer Premier 5软件设计简并引物：上游引物:5ᶄ-GCACCT-CAGAAKGATATTTGWCCYC -3ᶄ；下游引物:3ᶄ-TYTAAA-CAGCCCGAAGCGC MC -5ᶄ，在PCR 扩增仪上进行扩增，反应体系见表1㊂
PCR 反应条件:94ħ4min;94ħ30s,54ħ50s,72ħ90s,30个循环;72ħ延伸6min;4ħ保存㊂PCR 产物用1%
琼脂糖凝胶在120V 电压下电泳35min，最后通过凝胶成像系统得到PCR 产物条带并照相㊂
表1
巨鱼ND6基因PCR 反应体系
试剂
体积(μL)2ˑTaq PCR Master Mix
25.0上游引物(10pmol /μL) 2.0下游引物(10pmol /μL)
2.0DNA(80ng /μL)
2.0
ddH 2O
19.0合计
50.0 检测后的PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪下切下目的片段，用DNA 凝胶回收试剂盒(天根生物科技有限公司)进行回收纯化，具体步骤参照回收试剂盒说明书进行㊂
1.2.2 目的DNA 片段的连接与转化 用pMD18-T 载体与目的DNA 进行连接㊁转化，具体步骤参照载体连接试剂盒说明书进行，用LB 培养基进行扩大养后用M13进行阳性克隆筛选，送交南京金斯瑞科技生物公司测序㊂
1.3 数据分析
利用DNAMAN 5.0
软件将测得的巨
线粒体ND6基因
部分序列与参照物种ND6基因部分序列进行比对㊂利用MEGA 5.0软件中的Kimura2-parameter 方法计算遗传距离，采用邻接法(Neighbore -Joining,NJ)中的Maximum Composite Likelihood 法构建系统发育树，通过自举检验(Bootstrap)获得
系统分支的置信度(重复1000次)㊂2 结果与分析2.1 DNA 提取
从巨
鱼鳍条或肌肉提取DNA，结果见图1㊂可以看出,
DNA 条带清晰㊂
2.2 引物退火温度的优化
用设计的Bayam18引物退火温度的ʃ10ħ范围进行梯
度PCR(图2)，所用marker 为BM2000,Bayam18引物的退火温度梯度见表2㊂由图2可知,Bayam18号引物能扩增出条带的温度为55㊁55.6㊁56.4㊁57.5㊁59.2㊁60.7㊁61.9ħ，根据条带明亮度，初步确定Bayam18引物最适的退火温度㊂
2.3 扩增产物与DNA 回收利用凝胶回收试剂盒对PCR 产物(图3)进行回收，回收
产物(图4)于-20ħ保存㊂
2.4 菌液退火温度优化通过梯度PCR 优化M13通用引物的退火温度(图5)㊂M13通用引物序列见表3，退火温度梯度见表4㊂由图5
可
表2 梯度PCR 优化Bayam18引物退火温度泳道序号
温度梯度(ħ)
155.0255.6356.4457.5559.2660.7761.9863.39
64.81065.81166.51267.
知,M13通用引物在每个泳道都扩增出了明亮条带㊂
表3 M13引物序列
M13F(-47)
M13R primer NEW
5ᶄ-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC -3ᶄ3ᶄ-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG -5ᶄ
表4 梯度PCR 优化M13引物的退火温度泳道序号
温度梯度(ħ)
145.0246.0347.3449.3551.9654.4756.5858.89
61.31063.21164.21265.0
2.5
巨装配式公路钢桥
鱼ND6基因序列的碱基含量
本试验中，利用下载序列通过DNAMAN 5.0软件对比排
位，得到ND6基因片段长度516bp,12条序列中发现4个单倍型，其中6号㊁7号㊁11号个体序列相同，为1#单倍型;1号㊁
3号㊁4号㊁5号㊁8号㊁9号㊁12号个体序列相同，为2#单倍型;10号个体为3#单倍型;2号个体为4#单倍型㊂采用MEGA 5.0软件计算它们的碱基组成(表5)，可以得出T㊁C㊁A㊁G 4种碱基含量分别为14.10%㊁34.80%㊁40.10%㊁11.00%，其
中 A +T 含量(54.20%)高于 G +C 含量(45.80%)㊂
2.6
巨
鱼ND6基因12个个体的相对遗传距离
用MEGA 5.0软件中的双参数法，通过转换加颠换㊁转换
比颠换分别计算12个个体之间的相对遗传距离[15]，详见表
6㊂由表6可知,12个个体的4个单倍型之间的差异(转换加颠换)为0.002~0.004㊂
表5
巨
ND6序列碱基含量
单倍型含量(%)T
C风险把控
A
G
A +T G +C
总长(bp)Baya -ND6-114.1034.7040.1011.0054.2045.70516Baya -ND6-214.1034.7040.1011.0054.2045.70516Baya -ND6-314.0034.9040.1011.0054.1045.90516Baya -ND6-4
14.0034.9040.1011.0054.1045.90516平均值
14.1034.8040.1011.0054.2045.80
516
表6 12
条巨
鱼线粒体ND6遗传距离单倍型Baya -ND6-1Baya -ND6-2Baya -ND6-3Baya -ND6-4
Baya -ND6-10.000Baya -ND6-20.0000.000Baya -ND6-30.0020.0020.000Baya -ND6-4
0.002
0.002
0.004
0.000
注：数据是转换加颠换结果㊂
2.7 基于ND6基因构建系统发育树
将巨
鱼ND6基因与其他14物种(表7)进行比对，用
MEGA5.0软件构建系统发育树[16-17]，从图6可以看出，系统发育树分为两大支，巨
单独聚为1支㊂
表7 14
个
科种类及登录号物种
属名
登录号
大鳍异齿(Oreoglanis macropterus )
异齿属(Oreoglanis )NC 021607
黄斑褶(Pseudecheneis suLcata )
褶属(Pseudecheneis )NC 021605
云南拟(Pseudexostoma yunnanensis )
拟属(Pseudexostoma )
NC 021604
细尾(Pareuchiloglanis gracilicaudata
)属(Pareuchiloglanis )
NC 021603
安氏凿齿
(Glaridoglanis andersonii )
凿齿属(Glaridoglanis )NC 021600
扁头离(Creteuchiloglanis kamengensis )
离属(Creteuchiloglanis )NC 021599
黄石爬(Euchiloglanis kishinouyei )
石爬属(Euchiloglanis )NC 021598
摆线齿轮
黑斑原(Glyptosternon maculatum )
原属(Glyptosternon )NC 021598
长丝黑(Gagata dolichonema )
黑属(Gagata )NC 021597
藏(Exostoma labiatum
)属(Exostoma )
NC 021596
中华纹胸(Glyptothorax sinensis )
纹胸属(Glyptothorax )NC 024672
中华(Pareuchiloglanis sinensis
)
属(Pareuchiloglanis )
NC 024434
福建纹胸(Glyptothorax fokiensis )
纹胸属(Glyptothorax )NC 018769
三线纹胸(Glyptothorax trilineatus )
纹胸
属(Glyptothorax )NC 021608
3 讨论与分析
本试验通过从GenBank
数据库中查询已公布的
科巨
线粒体基因组中ND6基因序列保守区设计引物，采用PCR
反应扩增㊁
克隆及测序巨ND6基因，共得到12条ND6基
因全序列㊂
对巨线粒体ND6基因序列进行研究，得到ND6
基因全序列长516bp㊂
利用MEGA 5.0
软件分析对巨
鱼线粒体ND6基因12
个个体进行分析，得到T㊁C㊁A㊁G 这4种碱基含量分别为
14.10%㊁34.80%㊁40.10%㊁11.00%，其中 A +T 含量(54.20%)高于 G +C 含量(45.80%)，说明ND6基因序列中富含碱基A㊁T㊂共发现4个单倍型,3个变异位点，都为单突变位点，表明ND6基因序列多态性贫乏，序列之间差异不大，这与赖瑞芳等比较鲂属鱼类线粒体基因组，研究鲂属鱼类系统发育的结果[18]是一致的㊂ND6基因序列共发生3次颠换，表明本研究的4个单倍型的ND6基因核苷酸变异类型以
颠换为主㊂12个个体的4个单倍型之间平均相对遗传距离为0.003，转换和颠换的比值为0.667，表明这12个个体之间亲缘性近,ND6基因序列变异并不显著,
这与于美玲等对科鱼类系统发育关系的研究结果[19]一致㊂
此外，由系统发育树可知，系统发育树分为两大支，其中
巨
单独聚成1支，置信值为100%，表明与其他14
种
科
鱼亲缘性远㊂另一支又分为2支,
分别是细尾㊁
长丝黑先聚为1支,
黄石爬㊁
黑斑原
先聚为1支后，这4个种类
神通鬼大
进而聚为一个大的分支后与本研究的4
个巨聚在一起㊂
大鳍异齿
和中华
先聚为1支,
二者与三线纹胸
聚在一
起后与中华纹胸
聚为1支,
再与藏
聚在一起，然后与黄
斑褶
聚为较大的分支㊂
巨
单独聚成1支，这与形态学分
类结果与基于细胞素b(Cytochrome b)㊁rpS7基因研究的遗传进化是一致的
[20-21]
㊂
本研究通过研究巨
鱼ND6基因序
列多态性，可为以后研究巨与其他鱼类的亲缘性㊁系统进
化等研究提供科学依据㊂
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