文章编号：１００９－０００２（２００７）０４－０６００－０４研究报告用合成多肽免疫制备人α－半乳糖苷酶Ａ单克隆抗体 徐莉娟，季守平，高红伟，李素波，刘至玄，田曙光，宫锋，章扬培
军事医学科学院野战输血研究所，北京１００８５０
［摘要］目的：获得效价高的、特异性强的抗人α－半乳糖苷酶Ａ（α－ＧａｌＡ）单克隆抗体，用于法布莱氏病的诊断。方法：分析并合成人α－ＧａｌＡ的优势抗原表位，合成多肽，将其与载体匙孔虫戚血蓝蛋白偶联，免疫小鼠，采用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞株；用酶联免疫、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹和染体核型分析等方法对杂交瘤细胞及其产生的单抗进行鉴定。结果与结论：筛选到１株杂交瘤细胞株，获得了高效价、特异性强、亲和力高的抗人α－ＧａｌＡ的单克隆抗体，抗体的亚型为ＩｇＧ１亚型。 ［关键词］α－半乳糖苷酶Ａ；单克隆抗体；合成多肽；抗原表位；半固体培养基
［中图分类号］Ｒ３９２PＱ７８９［文献标识码］Ａhd180
ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎα－ＧａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＡＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ
ｗｉｔｈＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅ
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［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｏｂｔａｉｎｈｉｇｈｔｉｔｅｒａｎｄｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｈｕｍａｎα－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＡ（α－ＧａｌＡ）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒＦａｂｒｙｄｉｓｅａｓｅｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｄｏｍｉｎａｎｔｅｐｉｔｏｐｅｏｆｈｕｍａｎα－ＧａｌＡｗａｓａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．ＴｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓｗｅｒｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｔｏＫＬＨａｎｄＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＴｈｅｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｗｉｔｈＣＭｓｅｍｉｓｏｌｉｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＨＡＴ．Ｔｈｅｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄ
－ｉｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔａｓｗｅｌｌａｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｎａｌ－ｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ＆Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｏｎｅｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｈｉｇｈｔｉｔｅｒ，ｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙａｎｔｉｈｕｍａｎα－ＧａｌＡｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．ＴｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｂｅＩｇＧ１ｓｕｂｔｙｐｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＡPｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙPｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅPａｎｔｉｇｅｎｅｐｉｔｏｐｅPｓｅｍｉｓｏｌｉｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ
α－半乳糖苷酶（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，α－Ｇａｌ，ＥＣ３．２．１．２２）是外切糖苷酶类水解酶，其底物为末端含有α－半乳糖苷残基的寡糖、甘露糖及糖脂等的非还原性糖链［１］。定位于染体Ｘｑ２２的人α－半乳糖苷酶Ａ基因突变会导致Ｘ连锁隐性遗传病，即法布莱氏病（Ｆａｂｒｙｄｉｓｅａｓｅ）［２］。法布莱氏病可以通过临床症状、α－半乳糖苷酶酶活性测定及免疫学检测等方法进行诊断。由于患者早期临床症状不明显，很容易造成误诊；而当出现明显的症状时，患者的心脏、肾脏和神经系统已经发生不可逆转的损伤，因而法布莱氏病的早期诊断具有
重要意义。检测α－半乳糖苷酶Ａ是法布莱氏病早期诊断的重要方法，但容易出现漏诊的现象。将免疫学方法与酶活性检测方法相结合可以提高确诊率。我们采用合成的人α－半乳糖苷酶Ａ（α－ＧａｌＡ）抗原优势表位，应用杂交瘤技术制备了抗人α－ＧａｌＡ的单克隆抗体，为法布莱氏病的确诊提供了可靠的基础。
１材料和方法
１．１材料
匙孔虫戚血蓝蛋白（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ，ＫＬＨ）交联试剂盒（Ｓｉｇｍａ公司）；胎牛血清（国产）；ＲＰＭＩ－１６４０培养基、完全及不完全弗氏佐剂、ＨＡＴ／ＨＴ（Ｇｉｂｃｏ公司）；甲基纤维素４０００、ＰＥＧ、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ＩｇＧ（邦定生物公司）；ＳＰ２／０骨髓瘤细胞（本实验室保存）；雌性６～８周龄的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（本院实验动物中心提供）。Ｇ蛋白亲和层析预装柱（Ａｍｅｒｓｈａｍ公司）。
１．２抗原表位分析
采用ＢｉｏＳｕｎＶ１．０软件ＥｐｉｔｏｐｅＰｒｅｄｉｃｔ程序中的Ｅｐｉｔｏｐｅ方案预测人α－ＧａｌＡ的优势抗原表位。
１．３多肽合成及交联
采用Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ公司生产的ＮｏｖａｓｙｎＫＲ树脂，用固相合成法合成多肽，并在多肽的氨基末端添加１个半胱氨酸（Ｃ），以提供巯基。选择ＫＬＨ作为载体蛋白，按照试剂盒说明书提供的方法将合成的多肽与ＫＬＨ交联。
１．４免疫动物及杂交瘤制备
［收稿日期］２００６－１２－２６
［基金醒目］国家重点基础研究发展规划项目（２００２ＣＢ７１３８０４）
［作者简介］徐莉娟（１９７７－），女，博士研究生
［通讯作者］章扬培，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｈａｎｇｙｐ＠ｎｉｃ．ｂｍｉ．ａｃ．ｃｎ
以与ＫＬＨ交联的多肽为免疫原，对６～８周龄雌性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行皮下常规免疫，抗原用量为３０μｇ／只，每隔３周皮下加强免疫，初次免疫加完全弗氏佐剂，以后加不完全弗氏佐剂。融合前３ｄ检测小鼠血清多抗的效价，效价高者于尾静脉再追加免疫１次，剂量为８０～１００μｇ／只。３ｄ后收集免疫小鼠脾细胞，与ＳＰ２／０细胞以５∶１的比例在ＰＥＧ－４０００作用下融合，
然后依次加入２ｍＬＲＰＭＩ－１６４０、１０ｍＬ胎牛血清、２ｍＬ５０×ＨＡＴ、２５ｍＬ２％甲基纤维素半固体培养基，进行选择培养；７ｄ后，镜下挑选细胞集落，放入９６孔细胞培养板中，每孔加入１００μＬ含２％ＨＴ的ＲＰＭ１６４０培养基继续培养；３～４ｄ后，采用间接ＥＬＩＳＡ检测各孔上清液中的抗体含量，选择强阳性杂交瘤细胞克隆。将筛选的阳性克隆杂交瘤做有限稀释，进行３次亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞。
１．５染体核型分析
按照常规秋水仙碱阻断法［３］，将处于对数生长期的杂交瘤细胞用秋水仙素处理后，经裂解、固定和染，在油镜下观察细胞染体形态和数目。
１．６亚型鉴定
按照ＳｉｇｍａＩｍｍｕｎｏＴｙｐｅＴＭＫｉｔ说明，对筛选得到的杂交瘤细胞克隆培养上清进行单抗免疫球蛋白亚型鉴定。
１．７抗体纯化
扩大培养杂交瘤细胞，以１×１０６细胞腹腔接种于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，１０～１４ｄ后收集腹水。根据亚型鉴定的结果，选择ＨｉＴｒａｐｒＰｒｏｔｅｉｎＧＦＦ预装层析柱进行纯化。上样量为１
ｍＬ，上样流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，洗脱流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，结合液为０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４），洗脱液为０．１ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸－盐酸缓冲液（ｐＨ２．７），收集０．５ｍＬ／管。将纯化前／后的腹水、上样流出液、平衡流出液及杂蛋白洗脱液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，薄层扫描鉴定抗体的纯度。采用ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒测定抗体的含量。１．８抗体效价
采用ＥＬＩＳＡ法测定抗体效价，即以０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．６的碳酸盐缓冲液稀释α－ＧａｌＡ抗原（１ｍｇ／ｍＬ），按１００μＬ／孔加入酶标板，４℃包被过夜；弃去抗原溶液，用ＰＢＳ（含０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）洗板３次；每孔加入１５０μＬ含１０％小牛血清的ＰＢＳ，３７℃封闭０．５ｈ；倒掉封闭液，拍干，分别加入适当稀释的阴性对照腹水或不同稀释度的待测腹水（２倍倍比稀释）１００μＬ／孔，３７℃孵育１ｈ，洗板３次；加入ＨＲＰ标记的二抗ＩｇＧ（１∶２０００），１００μＬ／孔，３７℃孵育０．５ｈ，洗板３次；加入１ｍｇ／ｍＬ底物ＴＭＢ，用底物缓冲液稀释，含０．０１％Ｈ２Ｏ２，１００μＬ／孔，室温避光放置５～１０ｍｉｎ；用２ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４终止反应；测各孔的Ｄ４５０ｎｍ值。
１．９抗体特异性鉴定
将重组人α－ＧａｌＡ与重组咖啡豆的α－ＧａｌＡ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，然后按照Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹操作步骤转移到硝酸纤维素膜，依次加一抗（纯化的单抗）、二抗（ＨＲＰ标记的二抗ＩｇＧ），显影、定影，观察结果。
１．１０抗体亲和力测定
采用非竞争性ＥＬＩＳＡ法测定抗体的亲和力，即以０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．６的碳酸盐缓冲液稀释α－ＧａｌＡ抗原，终浓度分别为５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５、０ｎｇ／ｍＬ，加入酶标板，４℃包被过夜。一抗即纯化的单克隆抗体（从１∶１００开始２倍倍比稀释），然后加入ＨＲＰ标记的二抗ＩｇＧ（１∶２０００），显，终止反应后测各孔的Ｄ４５０ｎｍ值，绘制测定曲线，按照Ｂｅａｔｔｙ公式［４］计算单克隆抗体的亲和常数。
２结果
２．１抗原优势表位的选择
根据氨基酸的抗原指数、亲水性和表面的可能性等３个指标，以１３个氨基酸残基为单位，经ＢｉｏＳｕｎＶ１．０软件ＥｐｉｔｏｐｅＰｒｅ－ｄｉｃｔ程序中的Ｅｐｉｔｏｐｅ方案预测，发现了２段较好的抗原抗体结合特性的优势抗原表位，即序列１［ＰＱＲＤＳＥＧＲＬＱＡＤＰ（９８～１１０），预测指数为９．５１７０５］和序列２［ＬＧＫＱＧＹＱＬＲＱＧＤＮ（３２４－３３６），预测指数：８．４７４７４］（图１）。
２．２杂交瘤细胞系的建立
选择序列１与序列２的多肽与ＫＬＨ交联，免疫动物。经ＥＬＩＳＡ初筛，发现序列２具有很强的免疫原性，因此选择用序列２免疫的动物进行杂交瘤实验。经过筛选，获得了３株分泌抗α－半乳糖苷酶单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别命名为ＡＨＡＧＡ５、ＡＨＡＧＢ６和ＡＨＡＧＤ８。
２．３染体核型分析
选择ＡＨＡＧＡ５杂交瘤细胞进行染体核型分析，结果显示杂交瘤细胞约有１０４条染体（图２），为小鼠细胞染体（４０条）和ＳＰ２／０细胞染体（平均为６４条）之和，提示筛选的细胞为小鼠细胞和ＳＰ２／０的杂交细胞。传代后的杂交瘤细胞也获得相同的检测结果，说明获得杂交瘤细胞的性状稳定。
２．４单克隆抗体的亚型鉴定
按照ＳｉｇｍａＩｍｍｕｎｏＴｙｐｅＴＭＫｉｔ说明进行单抗免疫球蛋白亚
图２杂交瘤细胞染体分析
图１人α－半乳糖苷酶Ａ
优势抗原表位分析图
３讨论
法布莱氏病是一种罕见的、Ｘ染体连锁遗传的鞘糖脂类代谢疾病。法布莱氏病在男性中的发病率为１／４００００，若不能及时，一般在４０岁左右就会死于肾衰、
局部缺血或出血和心肌梗死。女性患者发病机理与Ｘ染体失活相关，发病时间比男性稍晚。法布莱氏病的早期不仅可以减轻患者的症状，而且可以预防肾衰、局部缺血或出血和心肌梗死等继发性疾病，显著延长患者的生存期，改善患者的生存质量，因而对法布莱氏病的早期诊断显得尤为重要。
法布莱氏病一般很难诊断，特别是在儿童阶段，由于没有典型的症状，很容易与其他疾病混淆。于是，研究者尝试使用分子生物学方法。检测蛋白标记Ｘ染体失活（ＬＡＭＰ－１／ｓａｐｏｓｉｎＣ）配合干全血斑点法（ｄｒｉｅｄｗｈｏｌｅｂｌｏｏｄｓｐｏｔｓ）检测人α－ＧａｌＡ的活性可以进行常规诊断和新生儿筛查［６－８］。研究发现，人α－Ｇａｌ包括α－
ＧａｌＡ和α
－ＧａｌＢ等２种，由于α－ＧａｌＢ有弱的α－ＧａｌＡ活性，因而在α－ＧａｌＡ完全缺失的法布莱氏患者体内也能够检测残留的α－
ＧａｌＡ活性（约１０％），从而导致误诊［５］。Ｍａｒｉａ等采用单抗与干全血
扬州1地升高风险10地升中风险斑点相结合的方法，检测患者体内的α－ＧａｌＡ活性和蛋白水平，可排除α－ＧａｌＢ的干扰，增加了法布莱氏病的确诊率［９］。因此，单克隆抗体检测技术在法布莱氏病的诊断中起着不可替代的作用。
在选择抗体制备的免疫原时，可以是整个蛋白，也可以是与载体蛋白交联的抗原表位［１０］。我们应用软件分析人α－半乳糖苷酶
型。结果显示，在包被ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ与ＩｇＡ的９６孔板上，抗体与包被ＩｇＧ１的反应能力最强，说明获得的抗α－
aac
ＧａｌＡ单抗属于ＩｇＧ１亚型（图３）。２．５
单克隆抗体的纯化
从ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱可以看出，上样流出液与平衡流出液泳道几乎没有单抗，而纯化后的单抗泳道可见杂蛋白几乎被去除，说明纯化的各项参数选择适中。另外，单抗在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱中呈现明显的２条带，相对分子质量分别为５３０００和２４０００，分别为抗体被ＳＤＳ解离的重链和轻链，没有明显的杂带（图４）。对应的薄层扫描结果显示，抗体蛋白的纯度超过了９８％，还原后重链的纯度为６４．１％，轻链为３４．３％。
根据蛋白浓度测定的标准曲线计算，纯化后单抗的含量约为１．６８ｍｇ／ｍＬ，推算１ｍＬ腹水可以得到纯化的抗体约为８．４
ｍｇ，表明杂交瘤细胞经动物体内诱生法可大量制备单抗。
ＥＬＩＳＡ法测定单克隆抗体的效价数据显示，单抗的效价为１∶１０５～１∶１０６。２．６
单克隆抗体的特异性
由Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹（图５）可以看出，泳道１（咖啡豆的α－ＧａｌＡ）没有任何条带，而泳道２与３均有单一的一条带，且带的宽度与人α－ＧａｌＡ的浓度成正比，这说明制备的单克隆抗体只与人的
α－半乳糖苷酶反应，而不与咖啡豆的α－ＧａｌＡ反应。即获得的单
克隆抗体具有很好的特异性。上海商学院图书馆
２．７单克隆抗体的亲和力测定
根据各孔的Ｄ４５０ｎｍ值绘制测定曲线（图６），读出每一包被抗
原的最大Ｄ４５０ｎｍ值的１／２所对应的抗体浓度，利用Ｂｅａｔｔｙ公式计算，纯化后的α－ＧａｌＡ单克隆抗体的亲和常数（Ｋ值）为８．２１×
１０１０／ｍｏｌ，说明所制备的单抗具有很强的亲和力。
图６
单克隆抗体的亲和力测定曲线
图３
单克隆抗体的亚型鉴定图
图４单克隆抗体纯化前后的电泳图谱
Ｍ：低分子量蛋白标准；１：纯化前腹水；２：上样流出液；
３：平衡流出液；４：纯化的单抗
图５单克隆抗体的Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹
１：ｒＣＡＧＡ；２：ｒＨＡＧＡ（５０μｇ／ｍＬ）；３：ｒＨＡＧＡ（１μｇ／ｍＬ
）
Ａ的氨基酸序列，获得了２个含多个亲水氨基酸的优势抗原表位，这是因为亲水性氨基酸和脯氨酸残基的多肽较其他序列更可能暴露在天然蛋白表面［１１－１３］。我们用化学方法合成上述多肽，并在多肽的氨基端加了１个Ｃｙｓ残基，便于与ＫＬＨ偶联。将多肽与载体蛋白偶联物作为免疫原免疫小鼠，用甲基纤维素半固体选择性培养法［１４］获得大量的融合细胞，经筛选获得３株高效价的、稳定的杂交瘤细胞株。从基础免疫到获得稳定的单克隆细胞历时４个月，大大提高了单抗制备效率。小鼠腹水单抗的传统纯化方法多为正辛酸、硫酸铵等沉淀法［１５］，虽然较简便，但往往会造成单抗的损失。我们采用更为简便的Ｇ蛋白亲和层析法，使单抗回收率大大提高，不但节省时间，还避免了正辛酸、硫酸铵等影响蛋白活性的成分的存在。通过Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、ＥＬＩＳＡ方法对单抗
进行鉴定，表明成功获得了高特异性、高效价、亲和力高的人α－ＧａｌＡ的单克隆抗体。利用获得的单克隆抗体与其他方法相结合，可以提高法布莱氏病的确诊率，同时也为深入研究法布莱氏病的诊断方法奠定了基础。
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