中文摘要
越南全民皆兵
脆性ｘ综合征是一种最常见的遗传性智力障碍性疾病，已经证实由脆性ｘ智力低下蛋白（ｆｒａｇｉｌｅｍｅｎｔａｉｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＦＭＲＰ）的表达缺失引起。目前已知ＦＭＲＰ是ＲＮＡ结合蛋白，其主要功能是结合某些特定类型的ｍＲＮＡｓ，并参与调节某些特定的靶ｍＲＮＡｓ的翻译，和／或参与这些ｍＲＮＡｓ从细胞核至细胞质，或从神经元细胞质至树突和突触后的蛋白质合成位点的转运。具体致病机制尚不清楚，但各种研究结果提示可能是ＦＭＲＰ的缺失引起了某些靶ｍＲＮＡｓ，特别是中枢神经系统的某些ｍＲＮＡｓ生理功能异常，从而导致疾病。因此研究体内与ＦＭＲＰ发生相互作用的靶ｍＲＮＡｓ有助于揭示ＦＭＲＰ缺失和各种临床表现之间的关系，。 酵母双杂交系统一直被广泛应用于研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。而酵母三杂交系统在此基础之上引入了一个可以在酵母体内表达ＲＮＡ终产物的质粒载体， 如果表达的ＲＮＡ产物可以和“诱饵”蛋白发生相互作用，就可激活报告基因的表达，从而筛选阳性克隆。因此被用于在真核细胞内研究蛋白质一ＲＮＡ之间的相互作用。我们通过构建酵母三杂交ｅＤＮＡ文库，运用酵母三杂交体系分析ＲＮＡ．蛋白质相互作用，研究与ＦＭＲＰ相互作用的ｍＲＮＡｓ。
ad637本课题的主旨是用酵母三杂交系统筛选人胚海马内的ＦＭＲＰ靶ｍＲＮＡｓ。脆性ｘ综合征相关基因ＦＭＲｌ在大脑海马区活跃表达，因此我们选用１９周胎龄人胚海马ｍＲＮＡ为材料，以ＲＮＡ表达质粒
ｐＲＩ－１５’为载体构建酵母三杂交ｃＤＮＡ文库。最终得到的独立克隆数约为１×１０６，文库的插入片段平均长度约为４００ｂｐ，有效重组克隆百分比约为９５％。然后将脆性ｘ智力低下基因ＦＭＲｌ的全长ｃＤＮＡ克隆到ｐＹＥＳ质粒中，转入Ｌ４０．ｕｒａ３酵母菌株。用此质粒表达的ＹＥＳＴｒｐ３／ＦＭＲＰ融合蛋白作为“诱饵”，对我们构建的文库进行筛查，筛选出在酵母体内与ＦＭＲＰ发生相互作用的靶ｍＲＮＡｓ。
到论文结稿时止，共发现三个与之相结合的ｍＲＮＡｓ，其中两个表达产物功能未知，另一个的表达产物是延伸因子１９ａｍｍａ（ＥＦ－１Ｔ）。ＥＦ．１蛋白水平的增高与无义抑制的增加相关，另一方面，ＥＦ－１表达增加可能通过改变细胞骨架肌动蛋白来导致生长缺陷和细胞形态的变化，肌动蛋白相关的树突棘的形状和稳定性的改变是脆性ｘ
综合征的特征之一。目前已有研究证实ＦＭＲＰ对ＥＦ。１基因的翻译起抑制作用。我们的研究结果发现ＦＭＲＰ与ＥＦ．１基因ｍＲＮＡｓ之间存在相互作用，为阐明ＦＭＲＰ影响ＥＦ．１基因的表达提供了新的证据。
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中国协和医科大学硕士论文
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ＬｏｓｓｏｆｔｈｅＦＭＲＰ（ｆｒａｇｉｌｅＸｍｅｎｔａｌｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎｐｍｔｅｉｎ）ｌｅａｄｓｔｏｆｒａｇｉｌｅＸｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｆｏｒｍｏｆｉｎｈｅｒｉｔｅｄｍｅｎｔａｌｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ．ＦＭＲＰｉｓａＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｏｓｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｓｔｏｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈｓｏｍｅｓｐｅｃｉａｌｍＲＮＡｓ，ａｎｄｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ，ｏｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｔｈｅｍｆｒｏｍｎｕｃｌｅｕｓｔｏｃｙｔｏｐｌａｓｍ，ｏｒｆｒｏｍｅｙｔｏｐｌａｓｍｔｏｐｍｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｓｙｎａｐｓｅｓａｎｄｄｅｎｄｒｉｔｅｓｉｎｎｅｕｒｏｎ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｐｔｕａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｕｌｌｋｎｏｗｎ，ｂｕｔｉｔｈａｓｂｅｅｎｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｌｏｓｓｏｆＦＭＲＰｌｅａｄｓｔｏｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｓｏｍｅｍＲＮＡｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｏｓｅｉｎｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｅｓｙｓｔｅｍ，ｗｈｉｃｈ
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ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄＥＦ一１Ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｉｇｈｔｉｔｓｅｌｆｉｎｇｒｏｗｔｈｄｅｆｅｃｔｓａｎｄｃｈａｎｇｅｓｉｎｃｅｌｌｕｌａｒｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｂｙａｌｔｅｒｉｎｇａｓｈａｓｂｅｅｎｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｙｅａｓｔ．Ａｃｔｉｎ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓｉｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓｐｉｎｅｓｈａｐｅａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙａｒｅａｗｅｌｌｋｎｏｗｎｆｅａｔｕｒｅｏｆｆｒａｇｉｌｅＸｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＳｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈｈａｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔＦＭＲＰｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅ．ＯｕｒｒｅｓｅａｒｃｈｈａｓｆｏｕｎｄｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＦＭＲＰａｎｄＥＦ一１ｍＲＮＡｓ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓｆｕｒｔｈｅｒｐｒｏｖｅｍｅｎｔｔｏｔｈｅｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＦ一１ｇｅｎｅ．
４
第一章前言
１．研究背景
脆性ｘ综合征是人中最常见的遗传性智力低下疾病，细胞遗传学分析显示与Ｘ染体长臂末端Ｘｑ２７．３脆性位点相关。通过定位克隆的方法，研究人员在此位点克隆了脆性Ｘ综合征基因ＦＭＲｌ
（ＦｒａｇｉｌｅＸｍｅｎｔａｌｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎｇｅｎｅ１，ＦＭＰ．１）０］ｏＦＭＲｌ由１７个外显子组成，在其５’非翻译区有一个ＣｐＧ岛，其后有ＣＧＧ三核苷酸重复序列Ｉ“。绝大部分脆性ｘ综合征患者是由于ＣｐＧ岛的异常甲基化和ＣＧＧ三核苷酸重复序列的异常扩增，引起ＦＭＲｌ基因失活或者表达降低所到１小，也有因ＦＭＲｌ基因点突变引起的病例‘５’６１。
分子蒸馏ＦＭＲｌ是一个广泛表达的基因，在脑和睾丸中表达最高，在心脏、肺、肾和胎盘中也有较高表达，在肝脏、前列腺、骨骼肌有较低表达‘７一】。其表达产物称为ＦＭＲＰ。ＦＭＲＰ是一个ＲＮＡ结合蛋白１９。ｏ】。序列分析表明ＦＭＲＰ含有两种ＲＮＡ结合结构域：ＫＨ结构域（核酸蛋白Ｋ同源结构域）和ＲＧＧ框（精氨酸甘氨酸簇）【１１】。说明它是一种多位点与ＲＮＡ相互作用的蛋白，该观点已被多种功能性实验所证实［１２－１４ｌ。
ＦＭＲＰ主要定位于细胞质，也见于核膜、核仁【１５—６１。ＦＭＲＰ有一个核定位信号（ＮｕｃｌｅａｒＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｅ，ＮＬＳ）和一个核输出信号（ＮｕｃｌｅａｒＥｘｐｏｒｔＳｅｑｕｅｎｃｅ，ＮＥＳ），可以穿梭于核与胞质之间‘切。ＦＭＲＰ还作为信使核糖核蛋白复合体（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｒｉｂｏｎｕｅｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｐａｒｔｉｅｌｅｓ，ｍＲＮＰｓ）的组份‘１８—９１，影响突触后及树突的具有翻译活性的多聚核糖体的功能。
上述特征提示ＦＭＲＰ的功能可能是调节某些特定的靶ｍＲＮＡｓ的翻译，和／或参与这些ｍＲＮＡ
通讯世界ｓ从细胞核至细胞质，或从神经元细胞质至树突和突触后的蛋白质合成位点的转运【２０‘２３１。研究人员认为ＦＭＲＰ通过其核定位信号被转运至核内，入核后它与数种蛋白质和一个特定亚的ｍＲＮＡｓ相互作用，形成ｍＲＮＰ复合体。然后此复合体通过ＦＭＲＰ的核输出信号输出至胞浆并定位于突触后位点。在此过程中，ｍＲＮＰ复合体中的ｍＲＮＡｓ一直处于无活性状态，直到突触的信号输入改变ＦＭＲＰ的活性，从而起始ｍＲＮＡｓ的翻译㈣。因此，脆性ｘ综合征患者的ＦＭＲＰ缺失，可能引起与之相互作用的ｍＲＮＡｓ的翻译异常，在一定程度上导致了患者的智力和生理改变。
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