江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２１ꎬ３７(２):４１２￣４１７
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吕㊀炫ꎬ张㊀淼ꎬ胡增金ꎬ等.鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的制备和鉴定[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２１ꎬ３７(２):４１２￣４１７.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２１.０２.０１８ 鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的制备和鉴定
吕㊀炫１ꎬ２ꎬ㊀张㊀淼１ꎬ㊀胡增金１ꎬ㊀李佳明１ꎬ㊀张㊀冲１ꎬ㊀朱英奇１ꎬ㊀魏娟文１ꎬ㊀吴㊀琼１ꎬ㊀张瑞辰１ꎬ㊀夏伦志３ꎬ㊀王桂军１ꎬ２
(１.安徽农业大学动物科技学院ꎬ安徽合肥２３００３６ꎻ２.兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室ꎬ安徽合肥２３００３６ꎻ
３.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所ꎬ安徽合肥２３００３６)
收稿日期:２０２０￣０９￣１２
基金项目：科技部国家重点研发计划项目(２０１８ＹＦＤ０５００１００㊁
２０１６ＹＦＤ０５００８０５)ꎻ安徽省家禽产业技术体系项目
(２０１９－２０２０)
作者简介：吕㊀炫(１９９６－)ꎬ男ꎬ安徽安庆人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向
为畜禽传染病防治ꎮ(Ｔｅｌ)１８７８８８４２８２０ꎻ(Ｅ￣ｍａｉｌ)
９６１５７９８７９＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者：王桂军ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｇｊ＠ａｈａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
㊀㊀摘要:㊀采用ＲＴ￣ＰＣＲ扩增获得鹅星状病毒(Ｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ)的衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７ꎬ并将其克隆至ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ原核表达载体ꎮ重组表达载体ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７经过测序和双酶切验证正确后ꎬ转化到感受态细胞Ｒｏｓｅｔｔａꎮ挑取阳性克隆子ꎬ利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达鹅星状病毒衣壳纤突重组蛋白ꎬ使用镍柱纯化衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎬ将定量的重组蛋白免疫ＢＡＬＢ/ｃ小鼠ꎮ利用ＥＬＩＳＡ㊁Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＩＦＡ鉴定鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体ꎮ结果显示ꎬ鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的效价大于１ʒ６４０００ꎬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验结果证明了鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的特异性ꎬＩＦＡ试验结果证明鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体能够识别天然的鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮ
东宫私人会所
关键词:㊀鹅星状病毒ꎻ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎻ多克隆抗体
中图分类号:㊀Ｓ８５８.３３２.６５＋９.６㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２１)０２￣０４１２￣０６
ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｔｈｅｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｏｆｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ
ＬＹＵＸｕａｎ１ꎬ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＭｉａｏ１ꎬ㊀ＨＵＺｅｎｇ￣ｊｉｎ１ꎬ㊀ＬＩＪｉａ￣ｍｉｎｇ１ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＣｈｏｎｇ１ꎬ㊀ＺＨＵＹｉｎｇ￣ｑｉ１ꎬ㊀ＷＥＩＪｕａｎ￣ｗｅｎ１ꎬ㊀ＷＵＱｉｏｎｇ１ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＲｕｉ￣ｃｈｅｎ１ꎬ㊀ＸＩＡＬｕｎ￣ｚｈｉ３ꎬ㊀ＷＡＮＧＧｕｉ￣ｊｕｎ１ꎬ２
(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｅｆｅｉ２３００３６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰａｔｈｏ￣ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌꎬＨｅｆｅｉ２３００３６ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ
ＡｎｈｕｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨｅｆｅｉ
２３００３６ꎬＣｈｉｎａ)
㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｔｈｅｖｐ２７ｇｅｎｅｏｆｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ￣ＰＣＲａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐｒｏ￣ｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌｖｅｃｔｏｒｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｌｖｅｃｔｏｒｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
ｃｅｌｌＲｏｓｅｔｔａａｆｔｅｒｖｅｒｉｆｉｅｄｔｏｂｅｃｏｒｒｅｃｔｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ.Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄꎬａｎｄｔｈｅｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｏｆｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓｂｙｉｓｏｐｒｏｐｙｌ￣β￣Ｄ￣ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ(ＩＰＴＧ).
ＴｈｅｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｎｉｃｋｅｌｃｏｌｕｍｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｍｍｕｎｅ
ＢＡＬＢ/ｃｍｉｃｅ.ＴｈｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｉｎｍｉｃｅｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＥＬＩＳＡꎬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄＩＦＡ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｉｔｅｒｏｆｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｉｎｍｉｃｅｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ１ʒ６４０００.Ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｐｏｌｙ￣
ｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｉｎｍｉｃｅｗａｓｐｒｏｖｅｄｂｙｔｈｅｔｅｓｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ.ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＩＦＡｔｅｓｔｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｃａｐ￣
２
固定宽带接入速率测试方法
１４
ｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｉｎｍｉｃｅｃｏｕｌｄｒｅｃｏｇｎｉｚｅｎａｔｕｒａｌｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｕｓꎻｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ꎻｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ
㊀㊀星状病毒(Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ)是一种单股正链无囊膜的ＲＮＡ病毒ꎬ可以感染哺乳动物和禽类ꎮ在哺乳动物中ꎬ星状病毒通常感染人㊁猪[１]㊁狗[２]和牛[３]等ꎬ主要引起胃肠炎和腹泻ꎬ在极个别条件下会引起脑炎[４]ꎮ在禽类动物中ꎬ星状病毒感染主要发生在鸡㊁鸭㊁鹅和火鸡中ꎬ引起鸡肾炎[５]㊁鸭致死性肝炎[６]㊁火鸡肠炎[７]等临床常见疾病ꎮ近年来ꎬ在安徽㊁江苏㊁福建等省份流行一种由鹅星状病毒(Ｇｏｏｓｅａｓｔｒｏｖｉｒｓ)感染引起雏鹅痛风为主要特征的疾病[８]ꎮ鹅星状病毒主要感染２１日龄左右的雏鹅ꎬ死亡率可达３０％ꎬ给养鹅产业带来极大的经济损失ꎮ
目前鹅星状病毒的检测主要依赖于ＲＴ￣ＰＣＲ方法ꎬ没有商品化的试剂盒[９]ꎮ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７作为存在于鹅星状病毒表面的衣壳纤突蛋白ꎬ含有中和抗原表位ꎬ介导鹅星状病毒粒子与细胞表面受体结合[１０]ꎮ相关研究结果表明ꎬ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７是鹅星状病毒主要的抗原决定蛋白[１１]ꎮ本研究以本实验室分离的鹅星状病毒ＤＹ￣１９株为基础ꎬ构建鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７原核表达载体ꎬ利用ＩＰＴＧ诱导表达和亲和层析柱纯化方法获得衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎬ免疫小鼠获得多抗血清ꎬ利用制备的多克隆抗体对感染新型鹅星状病毒的鸡肝癌细胞(ＣｈｉｃｋｅｎｌｉｖｅｒｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅꎬＬＭＨ)进行间接免疫荧光(Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ￣ｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙꎬＩＦＡ)检测ꎬ为鹅星状病毒早期
检测方法的建立和应用以及后续研究奠定基础ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀材料
ＤＨ５α和Ｒｏｓｅｔｔａ大肠杆菌感受态细胞采购于通用公司ꎬＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ㊁限制性内切酶ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ采购于宝日医生物技术(北京)有限公司ꎬ２ˑｔａｐＰＣＲＭｉｘ㊁质粒小提试剂盒㊁胶回收试剂盒购自天根公司ꎬ胎牛血清(ＦｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍꎬＦＢＳ)购自Ｇｉｂｃｏ公司ꎬＨＲＰ标记的羊抗小鼠ＩｇＧ和４ᶄꎬ６￣二脒基￣２￣苯基吲哚(４ᶄꎬ６￣ｄｉａｍｉｄｉｎｏ￣２￣ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅꎬＤＡ￣ＰＩ)㊁异硫氰酸荧光素(ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅꎬＦＩＴＣ)标记的羊抗小鼠ＩｇＧ购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司ꎬ异丙基硫代半乳糖苷(Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ￣Ｄ￣ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅꎬＩＰＴＧ)购自ｂｉｏｓｈａｒｐ公司ꎬＤＭＥＭ￣Ｆ１２培养基购自ＨｙＣｌｏｎｅ公司ꎮＬＭＨ细胞系㊁ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ载体㊁鹅星状病毒ＤＹ￣１９株(ＧｅｎＢａｎｋ:ＭＴ７０８９０２)由本实验室分离和保存ꎮＢＡＬＢ/ｃ小鼠购自安徽医科大学实验动物中心ꎮ
１.２㊀方法
电子产品设计与制作
１.２.１㊀衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７的ＲＴ￣ＰＣＲ扩增㊀根据鹅星状病毒ＤＹ￣１９株全基因序列(ＧｅｎＢａｎｋ:ＭＴ７０８９０２)ꎬ利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５.０软件设计引物ꎬ扩增鹅星状病毒衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７ꎬ扩增的衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７片段大小为７２３ｂｐꎮ同时在上㊁下游引物５ᶄ端分别添加ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点ꎮｖｐ２７基因的引物序列如表１所示ꎮ
表１㊀ｖｐ２７基因的引物
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｏｆｖｐ２７ｇｅｎｅ
引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀
ｖｐ２７￣ＦＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＴＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＴＴＧＴＧ
ｖｐ２７￣ＲＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡ
单下划线部分为ＢａｍＨⅠ酶切位点ꎬ双下划线部分为ＨｉｎｄⅢ酶切位点ꎮ
１.２.２㊀重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７的构建㊀将胶回收的衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７目的片段和ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ质粒利用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶分别进行双酶切ꎮ反应总体系
５０μｌꎬ其中１０ˑＫｂｕｆｆｅｒ５μｌꎬＢａｍＨⅠ２μｌꎬＨｉｎｄⅢ２μｌꎬ利用无菌去离子水补足ꎮ于３７ħ水浴锅酶切３ｈꎬ衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７片段㊁ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ质粒的酶切产物电泳后利用胶回收试剂盒分别进行回收ꎮ
将衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７片段㊁ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ质粒的胶回收产物进行连接ꎬ反应总体系１０μｌ：衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７片段４μｌꎬｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ质粒胶回收产物１μｌꎬＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ５μｌꎮ于１６ħ条件下连接４ｈꎮ吸取连接产物１０μｌ转化到感受态细胞Ｒｏｓｅｔｔａꎮ利用ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ载体的氨苄抗性进行筛选ꎮ在氨苄琼脂平板上挑取单个菌落进行ＰＣＲ鉴定ꎮ对于ＰＣＲ鉴定阳性的单个菌落摇菌提取质粒ꎬ利用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶进行双酶切鉴定ꎬ同时将质粒进行测序ꎮ鉴定正确后将重组质粒
３１４
吕㊀炫等：鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的制备和鉴定
命名为ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎮ
１.２.３㊀重组衣壳纤突蛋白ＶＰ２７的诱导表达和纯化㊀将鉴定正确的重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７转化到大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａꎬ挑取阳性菌落ꎬ进行ＩＰＴＧ浓度优化(终浓度０ ５ｍｍｏｌ/Ｌ
㊁１ ０ｍｍｏｌ/Ｌ㊁１ ５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁２ ０ｍｍｏｌ/Ｌ)ꎬ１６ħ㊁１２０ｒ/ｍｉｎ诱导２４ｈꎮ收集菌体后ꎬ利用超声波细胞粉碎机破碎细菌ꎬ细菌破碎后８０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ分别保存重组星状病毒衣壳纤突蛋白上清液和沉淀ꎮ取星状病毒重组衣壳纤突蛋白质上清液和沉淀分别加入蛋白质上样缓冲液进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析ꎮ受弯
１.２.４㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７免疫及多克隆抗体制备㊀按照上述方法大量制备衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎬ以纯化定量后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７为抗原免疫６周龄ＢＡＬＢ/ｃ雌性小鼠ꎮ免疫程序如下：第１次免疫ꎬ１００μｌ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７(１００μｇ)和１００μｌ的等体积弗氏完全佐剂完全混合后ꎬ皮下注射ꎻ１４ｄ后进行第２次免疫ꎬ１００μｌ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７(１００μｇ)和１００μｌ的等体积弗氏不完全佐剂完全混合ꎬ皮下注射ꎻ第１次免疫后２８ｄ进行第３次免疫ꎬ免疫方法与第２次免疫相同ꎮ第３次免疫后７ｄꎬ腹腔注射衣壳纤突蛋白ＶＰ２７加强免疫ꎬ１只１００μｇꎮ应用ＥＬＩＳＡ方法测定其效价ꎮ
１.２.５㊀ＥＬＩＳＡ检测多克隆抗体的效价㊀用碳酸盐缓冲液包被纯化后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７(１０μｇ/ｍｌ)ꎬ将包被好的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７加入９６孔板ꎬ１孔１００μｌꎬ４ħ包被过夜ꎮ第２ｄ早晨ꎬ弃掉９６孔板中的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７包被液ꎬ用配制好的ＰＢＳＴ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ在室温条件下ꎬ用５％的脱脂奶粉溶液(５０ｇ/ＬꎬＰＢＳＴ配制)封闭１ｈꎬ甩掉５％脱脂奶粉溶液ꎬ用ＰＢＳＴ洗涤４次ꎬ在微量振荡器上振荡５ｍｉｎꎬ最后拍干确保孔内无ＰＢＳＴ残留ꎬ然后用三维牵引床
５％脱脂奶粉溶液稀释免疫小鼠的血清样品(１ʒ５００㊁１ʒ１０００㊁１ʒ２０００㊁１ʒ４０００㊁１ʒ８０００㊁１ʒ１６０００㊁１ʒ３２０００㊁１ʒ６４０００)ꎬ８个稀释度ꎬ每孔１００μｌ稀释好的样品ꎬ对照组为未经免疫的小鼠血清ꎬ于３７ħ培养箱孵育２ｈꎬ甩掉稀释的血清样品ꎬ用ＰＢＳＴ洗涤４次ꎬ在微量振荡器上振荡５ｍｉｎꎬ最后拍干确保孔内无ＰＢＳＴ残留ꎬ然后将羊抗小鼠ＩｇＧ￣ＨＲＰ按照１ʒ２０００进行稀释(稀释液为５％脱脂奶粉溶液)ꎬ每孔加入１００μｌꎬ于３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ甩掉孔内液体ꎬ用ＰＢＳＴ洗涤４次ꎬ在微量振荡器上振荡５ｍｉｎꎬ最后拍干确保孔内无ＰＢＳＴ残留ꎬ在室温条件下每孔加入１００μｌＴＭＢ显液ꎬ避光反应１５ｍｉｎꎬ最后每孔加入１００μｌ硫酸溶液(２ｍｏｌ/Ｌ)终止反应ꎮ使用酶标仪检测各孔样品吸光值Ａ４５０ꎮ１.２.６㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体㊀将利用ＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ空载体和纯化浓缩后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７经ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分离后转到ＰＶＤＦ膜上ꎬ５０ｇ/Ｌ脱脂奶粉溶液(ＰＢＳ配制)３７ħ培养箱封闭１ｈꎬ用配制的ＴＢＳＴ洗涤３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎬ一抗为１ʒ２００稀释的鼠血清(ＰＢＳ稀释)ꎬ于３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ然后用配制的ＴＢＳＴ缓冲液洗涤ＰＶＤＦ膜３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎻ二抗为１ʒ２０００稀释的带ＨＲＰ标记的羊抗小鼠ＩｇＧ(ＰＢＳ稀释)ꎬ然后用配制的ＴＢＳＴ缓冲液洗涤ＰＶＤＦ膜３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎬ最后用ＤＡＢ试剂盒显观察ꎮ１.２.７㊀ＩＦＡ鉴定衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体㊀将处理好的ＬＭＨ细胞均匀铺到６孔板ꎬ待其密度达到８０％以上ꎬ３孔接种鹅星状病毒ＤＹ￣１９ꎬ剩余３孔为对照组ꎬ使用ＤＭＥＭ￣Ｆ１２培养基代替鹅星状病毒ꎮ鹅星状病毒感染ＬＭＨ细胞７２ｈ后ꎬ用移液弃掉维持
液ꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ每孔加入２ｍｌ５％脱脂奶粉溶液(ＰＢＳ配制)封闭液ꎬ３７ħ培养箱封闭１ｈꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎮ一抗为１ʒ２００稀释的制备的抗鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体(ＰＢＳ配制)ꎬ３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎻ二抗为１ʒ１０００稀释的带ＦＩＴＣ标记的羊抗小鼠ＩｇＧꎬ３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ加入１ｍｌ１ʒ１０００稀释的ＤＡＰＩ(ＰＢＳ配制)溶液ꎬ３７ħ培养箱孵育１０ｍｉｎꎬ然后沿着侧壁加入ＰＢＳ洗涤３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ最后加入６００μｌＰＢＳꎬ置于荧光倒置显微镜下进行观察ꎮ
２㊀结果
２.１㊀衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７的ＲＴ￣ＰＣＲ扩增以制备的鹅星状病毒ＤＹ￣１９的ｃＤＮＡ为模板ꎬ进行衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７扩增ꎮ衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７扩增目的条带大小在７２３ｂｐ左右ꎬ与预期结果相符(图１)ꎮ
２.２㊀重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７鉴定
构建的重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７经ＢａｍＨⅠ和
４１４江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第２期
Ｍ:ＤＬ２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１:ｖｐ２７基因ＰＣＲ扩增产物ꎮ
图１㊀衣壳纤突蛋白基因ｖｐ２７ＰＣＲ扩增产物电泳图
Ｆｉｇ.１㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｄｉａｇｒａｍｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｖｐ２７ｇｅｎｅｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｓｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ
ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶双酶切ꎬ得到了７２３ｂｐ的目的基因片段和４.７ｋｂ的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ载体片段ꎬ与预期大小相符(图
２)ꎮ
集成电路布图设计Ｍ:ＤＬ５０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１:ｐＣｏｌｄ￣ＶＰ２７经ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切产物ꎮ
图２㊀ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７载体的双酶切鉴定
Ｆｉｇ.２㊀ＤｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ｖｅｃｔｏｒ
２.３㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７的表达㊁鉴定和纯化将转入重组质粒ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７的表达菌Ｒ
ｏｓｅｔｔａ培养至Ａ６００＝０.６~０ ８ꎬ用４个不同浓度(０ ５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁１ ０ｍｍｏｌ/Ｌ㊁１ ５ｍｍｏｌ/Ｌ㊁２ ０ｍｍｏｌ/Ｌ)的ＩＰＴＧ诱导ꎬ１６ħ㊁１２０ｒ/ｍｉｎ诱导表达２４ｈꎮＳＤＳ￣ＰＡＧＥ结果显示ꎬ在相对分子质量约为４３０００处出现特异性条带(图３)ꎬ选择终浓度１ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ进行蛋白质表达ꎮ未经诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７无目的条带ꎮ可溶性分析结果表明衣壳纤突蛋白ＶＰ２７在沉淀和上清液中均可表达ꎮ收集破碎离心后上清液利用亲和层析法纯化衣壳纤突蛋白
ＶＰ２７ꎮ
Ｍ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１:０ ５ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ２:１ ０ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ３:１ ５ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ４:２ ０ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ５：未诱导的ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７ꎻ６:１
０ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄꎻ７：未诱导的ｐＣｏｌｄꎮ
图３㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７原核表达
Ｆｉｇ.３㊀ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７２.４㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的效价第４次加强免疫后７ｄꎬ采集并分离小鼠血清ꎬ用ＥＬＩＳＡ方法检测血清中衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的效价ꎮ结果表明制备的鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７血清效价大于１ʒ６４０００(图４)ꎬ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７经４次免疫小鼠后诱导机体产生了抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７特异性多克隆抗体
ꎮ
ａ:１ʒ５００ꎻｂ:１ʒ１０００ꎻｃ:１ʒ２０００ꎻｄ:１ʒ４０００ꎻｅ:１ʒ８０００ꎻｆ:１ʒ１６０００ꎻｇ:１ʒ３２０００ꎻｈ:１ʒ６４０００ꎮ
图４㊀ＥＬＩＳＡ方法测定的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体效价Ｆｉｇ.４㊀ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｏｆｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｂｙｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙ(ＥＬＩＳＡ)
２.５㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法鉴定
㊀㊀以经ＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ空载体和纯化后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７为抗原ꎬ免疫小鼠后获得的血清为一抗ꎬ二抗为带ＨＲＰ标记的羊抗小鼠
５１４
吕㊀炫等：鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的制备和鉴定
ＩｇＧꎮ结果显示ꎬ经ＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ空载体组无明显条带ꎬ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７在相对分子质量４３０００处有一条明显的条带(图５)ꎮ证明制备的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体特异性良好
ꎮ
Ｍ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１：经ＩＰＴＧ诱导的ｐＣｏｌｄ￣ＳＵＭＯ空载体ꎻ２：纯化后的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮ
图５㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体
Ｆｉｇ.５㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｐｓｉｄｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＶＰ２７ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉ￣ｂｏｄｙｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
２.６㊀衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体的ＩＦＡ鉴定将衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体应用于病毒的ＩＦＡ检测ꎬ结果表明制备的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体可以识别天然的衣壳纤突蛋白Ｖ
Ｐ２７ꎬ感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞质中检测到明显的荧光信号ꎬ未感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞中未检测到荧光信号(图６)ꎮ表明制备的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体可以应用于病毒的ＩＦＡ检测ꎮ
３㊀讨论
１９７５年ꎬ星状病毒首次在婴儿粪便中被发现ꎬ因其在透射电子显微镜下具有特征性的五角星结构ꎬ故将其命名为星状病毒[１２]ꎮ随着现代分子生物学和病原检测技术的发展ꎬ越来越多的星状病毒在哺乳动物和鸟类动物中被发现[１３￣１５]ꎮ导致动物腹泻的主要病原体之一就是星状病毒ꎬ同时星状病毒还会感染机体的其他组织脏器ꎬ导致雏鸭致死性肝炎㊁鸡肾炎和哺乳动物脑炎等[１６]ꎮ鹅星状病毒感染雏鹅ꎬ主要引起雏鹅的内脏器官㊁腿部关节乃至腿部肌肉出现尿酸盐沉积ꎬ给养鹅产业造成巨大的经济损失[１７￣１８]ꎮ
目前ꎬ鹅星状病毒的检测方法主要是ＲＴ￣ＰＣＲ方法[１９]ꎬ包括鹅星状病毒ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光定量检测[２０]和鹅星状病毒ＴａｑＭａｎ荧光定量检测[２１]ꎮ
ＲＴ￣
Ａ：感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞ꎻＢ：未感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞ꎮＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光素ꎻＤＡＰＩ:４ᶄꎬ６￣二脒基￣２￣苯基吲哚ꎻＭｅｒｇｅ：融合ꎮ
图６㊀间接免疫荧光细胞化学染法检测ＬＭＨ细胞ＶＰ２７蛋白表达
Ｆｉｇ.６㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶＰ２７ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＬＭＨｃｅｌｌｓｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ
ＰＣＲ方法主要采集发病或者病死雏鹅的部分组织器官ꎬ提取核酸进行检测ꎬ不适合在临床上进行大规模检测ꎮ建立一种基于衣壳纤突蛋白ＶＰ２７的ＥＬＩＳＡ检测方法ꎬ应用于临床上大规模检测尤为迫切ꎮ
衣壳纤突蛋白ＶＰ２７为存在于鹅星状病毒粒子表面的蛋白质ꎮ相关研究结果表明ꎬ鹅星状病毒衣壳纤突蛋白ＶＰ２７是鹅星状病毒的主要抗原决定蛋白ꎬ参加鹅星状病毒粒子与细胞内外受体的结合ꎮ因此ꎬ衣壳纤突蛋白ＶＰ２７可以作为疾病检测和疫苗研制的靶点[２２]ꎮ本研究通过构建ｐＣｏｌｄ￣ｖｐ２７原核质粒ꎬ利用大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ表达系统ꎬ优化蛋白质表达条件(ＩＰＴＧ浓度)ꎬ获得
高效表达的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮ将衣壳纤突蛋白ＶＰ２７纯化定量后与弗氏佐剂混合ꎬ免疫小鼠ꎬ经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测证明抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体血清的特异性良好ꎬ与对照组无特异性反应ꎮ同时应用间接ＥＬＩＳＡ方法检测制备的鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７多克隆抗体效价大于１ʒ６４０００ꎮ使用感染鹅星状病毒ＤＹ￣１９的ＬＭＨ细胞对多克隆抗体使用ＩＦＡ法进行鉴定ꎬ感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞中有明显的绿荧光ꎬ而未感染鹅星状病毒的ＬＭＨ细胞无荧光ꎬ证明制备的抗体特异性非常好ꎬ可以特异性识别天然的衣壳纤突蛋白ＶＰ２７ꎮ综上所述ꎬ制备的鼠抗衣壳纤突蛋白ＶＰ２７可以用于临床鹅星状病毒的检测和实验室中鹅星状病毒特性研究以及致病机制研
６１４江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第２期
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