作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2017, 43(1): 31-41 /
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal DOI: 10.3724/SP.J.1006.2017.00031
甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因ScD27的克隆与表达分析 吴转娣**刘新龙**刘家勇昝逢刚李旭娟刘洪博林秀琴
陈学宽苏火生赵培方吴才文*
云南省农业科学院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 云南开远661699
摘要: 独脚金内酯(strigolactones, SLs)是一类新型植物激素, D27基因是独脚金内酯生物合成途径中最上游的调控 鄢礼华
基因, 且该基因调控SLs的合成是一个可逆的过程。本研究根据水稻、玉米、高粱、二穗短柄草4种禾本科作物的
D27基因核苷酸序列保守区域设计引物, 以甘蔗品种ROC22的cDNA为模板, 利用RT-PCR和RACE技术, 从甘蔗 中克隆出D27基因的cDNA全长序列, 命名为ScD27, GenBank登录号为KP987221.1。该基因序列全长1379 bp, 包
含一个867 bp的完整开放阅读框(ORF), 编码288个氨基酸残基。ScD27编码的蛋白质分子量为71.58 kD, 理论等电 点为5.04, 是一种非分泌性蛋白, 主要分布于叶绿体上, 该蛋白的保守区可能具有2个锌指蛋白结构域(ZnF_TAZ和
ZnF_A20), 且不存在信号肽; 该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性, 与高粱、谷子、大麦、短穗二柄草等禾本
科植物的D27氨基酸序列相似性在70%以上; ScD27基因在甘蔗各组织部位均有表达, 其中茎尖和腋芽中表达量较高, 叶、茎和根中的表达较低。此外, ScD27基因在甘蔗茎尖中的表达受PEG、盐胁迫、磷缺乏和营养缺乏的诱导, 推测ScD27基因是甘蔗独脚金内酯生物合成途径中响应非生物胁迫的关键基因。
关键词：甘蔗; ScD27; 同源克隆; 生物信息学; q-PCR
Cloning and Expression Analysis of Key Gene ScD27 in Strigolactones Biosynthesis Pathway
WU Zhuan-Di**, LIU Xin-Long**, LIU Jia-Yong, ZAN Feng-Gang, LI Xu-Juan, LIU Hong-Bo, LIN Xiu-Qin, CHEN Xue-Kuan, SU Huo-Sheng, ZHAO Pei-Fang, and WU Cai-Wen*
Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699, China
Abstract: Strigolactones (SLs) is a novel class of plant hormones. D27 regulating reversible metabolic process is located in
up-stream of strigolactones biosynthesis pathway. In this study, primers were designed based on the conserved domains from four species inluding Oryza sativa, Zea mays, Sorghum bicolor, and Brachypodium distachyon. Using cDNA from sugarcane cultivar ROC22 as the template, the full-length cDNA sequence of D27 gene from sugarcane was cloned by RT-PCR and RACE method. This gene is named as ScD27, with the GenBank accession number of KP987221.1. Its length is 1379 bp, and it contains an 867
bp open reading frame (ORF), encoding 288 amino acid residues. ScD27 is not a secretory protein and has a molecular weight of 71.58 kD, with a theoretical isoelectric point of 5.04. ScD27 is mainly located in chloroplast and the conserved domains of this protein involve two zinc finger protein struct
ures (ZnF_TAZ and ZnF_A20). Amino acid sequences encoded by ScD27 shared more than 70% similarity with the reported amino acid sequences encoded by D27 of Sorghum bicolor, Setaria italica Beauv.,
本研究由国家自然科学基金项目(31360359), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-20-1-1), 云南省中青年学术技术带头人后
备人才(2014HB038), 云南省应用基础研究计划项目(2016FB071), 重大科技专项-生物(2015ZA001)和科技创新人才计划(2014HC015)
资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31360359), the National Modern Agricultural Industry Technology System Construction Project (CARS-20-1-1), the Young and Middle-aged Academic Technology Leaders Reserve Talented Per-son in Yunnan Province (2014HB038), the Applied Basic Research Projects in Yunnan Province (2016FB071), the Major Science and Tech-nology Projects – Biology (2015ZA001), and the Science and Technology Innovation Talents Project (2014HC015).
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* 通讯作者(Corresponding author): 吴才文, E-mail: gksky_wcw@163 **同等贡献(Contributed equally to the work)
第一作者: 吴转娣, E-mail: judith1123@126; 刘新龙, E-mail: lxlgood868@163
Received(收稿日期): 2016-01-11; Accepted(接受日期): 2016-09-18; Published online(网络出版日期): 2016-09-28.
URL: wwwki/kcms/detail/11.1809.S.20160928.0948.006.html
32作物学报第43卷Hordeum vulgare subsp. vulgare and Brachypodium distachyon. ScD27 gene was differentially expressed in different parts of sugarcane plant, with higher level of transcript in stem tip and axillary bud but much lower level in leaf, stem and root. Further-more, the expression of ScD27 could be induced by the stresses of PEG, salt and the deficiencies of phosphorus and nutrition. These results demonstrated that ScD27 might be a key gene participating in the response to abiotic stresses during sugarcane SLs biosynthesis pathway.
Keywords: Sugarcane; ScD27; Homology cloning; Bioinformatics; q-PCR
农作物的生长发育主要受植物激素的调控, 如作物的株型、水分和营养的利用以及对生物和非生物胁
迫的适应性等, 因此植物激素对作物产量的形成与品质的保持发挥至关重要的作用[1]。甘蔗(Saccharum spp.)是世界上最重要的糖料作物, 在其生长发育和逆境胁迫适应过程中受到多种激素信号的调控作用[2-3]。因此, 研究植物激素调控甘蔗重要农艺性状、抗逆性状表现的生理分子机制对于甘蔗品种产量性状的改良具有重要的理论和实践意义。
独脚金内酯(strigolactones, SLs)属于类萜内酯类植物激素, 该激素能够促进寄生植物种子的萌发和植物与共生真菌之间的相互作用, 对于植物的分枝和逆境胁迫调控也具有重要作用[4-6], 前人研究表明, 独脚金内酯是作为第二信使在抑制植物分枝上发挥作用, 当植物营养受到限制时, SLs会在植物的根部生成并促进侧根和根毛的生长, 同时SLs被运输至植物的出芽位置, 抑制侧芽生长, 从而增加植物根部对无机营养物质的捕获, 减少分蘖对营养的需求[7]。
此外, SLs还具有促进节伸长、加快叶片衰老、促进根毛伸长和次生根生长、增加茎粗度诱导二次生长、响应逆境胁迫等作用[8-10]。迄今, 通过对多种模式植物如拟南芥[11-12]、矮牵牛[13-15]、豌豆[16]、水稻[17-20]等的研究, 初步明确SLs的合成及信号传导途径在调控植物分枝形成和响应逆境胁迫的功能作用。一系列相关基因也被陆续克隆出来, 如CCD7/D17/HTD1[21]、CCD8/D10[22-23]、D27[20,24-25]、MAX1[26]等基因主要参与独脚金内酯的合成[27]。D14[26,28]、D3[29-30]、D53[31]主要参与独脚金内酯的信号传导途径[32-35], 当具有活性的独脚金内酯与D14蛋白结合, 诱导D14的构象变化, 使D3和D53结合, 以促进D53蛋白的泛素化, 最终使D53蛋白降解, 独脚金内酯得以正常应答。
在独脚金内酯合成途径中, D27 (DWARF27)是一个叶绿体定位的铁结合蛋白, 为独角金内酯生物合成的一个重要成员, 当D27基因突变后生长素的极性运输增强, 根部分泌液中检测不到独角金内酯, 导致分蘖芽向外生长的抑制作用被解除而呈多分蘖表型[18,20]。对水稻D27基因的研究表明, 它被定位于水稻的第11染体, 主要在幼叶、腋芽、花序原基、侧根和冠状根中表达, 尤其是在主茎地上部顶端和幼叶以及节和节间的维管束细胞中表达[20]。氨基酸序列的比对分析发现, 从低等的藻类到高等植物广泛存在D27的同源蛋白。
SLs的生物合成受其自身和外部环境条件的共同调节, 植物可能通过调节SLs合成基因的转录水平来调控SLs的合成和分泌[36-37], SLs还可能通过调控植物的分枝来响应外部环境的胁迫, 如磷胁迫[38]等。研究发现, 在磷缺乏条件下, 三叶草[39]和番茄[40]中SLs的生物合成量大幅提高, 进而导致分枝减少。另有研究发现, 磷缺乏还可能影响SLs的生物活性[6,37]。从拟南芥max2突变体对干旱胁迫敏感性的研究发现, SLs类似物GR24能够提高SLs缺失突变体对干旱的抵抗能力, 同时也能提高野生型植株的耐旱性[41-42]。SLs不仅可以调控芽的生长, 还能调控初生根、侧根的发育以及根毛的延长, 在逆境条件下(如磷缺乏、干旱和盐胁迫), 植物会通过抑制芽的生长, 增强根系生长, 从而提高植物应对逆境的能力, 最终影响整个植物的形态建成[43-44]。
甘蔗D27基因是否也参与甘蔗品种分蘖形成、形态构建和逆境胁迫响应, 依然是不清楚的。本研究利用基因克隆技术, 从甘蔗中克隆出D27基因的同系物, 并通过生物信息学和实时荧光定量PCR技术分析其
序列结构特点和表达模式, 以期为SLs对甘蔗品种发育和重要性状的分子调控功能的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
亚瑟王2:亡灵军团选用我国蔗区种植面积最大的主栽品种ROC22, 剪取处于分蘖期的甘蔗茎尖, 提取其总RNA。甘蔗品种ROC22由云南省甘蔗遗传改良重点实验室提供。大田中选取生长健壮并长势一致的ROC22蔗茎, 砍成单芽茎段, 洗净并52℃温水脱毒处理30 min。温室中取45 d的甘蔗幼苗, 参考李晓君的方法[45], 设置6种处理: 即以10% (w/v) PEG-6000的MS培
第1期
吴转娣等: 甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因ScD27的克隆与表达分析 33
养基; 20% (w/v) PEG-6000的MS 培养基; 200 mmol L –1 NaCl 的MS 培养基; 300 mmol L –1 NaCl 的MS 培养基; 1/8 mmol L –1的磷缺乏; 纯水培养(营养缺乏)。于不同处理的不同时间0 (对照)、6、12、24、48、72和96 h 取茎尖, 立即投入液氮速冻, 并保存于–80℃, 用于提取总RNA 。
1.2 甘蔗茎尖总RNA 的提取和cDNA 第1链的合成
提取总RNA 参照全式金公司RNA Plant Kit 说明书, 以RNAase-Free H 2O 溶解RNA, NanoDrop 测定RNA 浓度, 根据OD 260/OD 280和OD 260/OD 230评估RNA 质量, 通过1%琼脂糖凝胶电泳的结果判断RNA 的完整性, 存于–70℃备用。取1 μg 茎尖总RNA 按照TaKaRa 公司的RNA PCR Kit 试剂盒说明书合成 cDNA 。
1.3 甘蔗ScD27基因同源片段的克隆
以NCBI 检索的二穗短柄草(Brachypodium dis-tachyon )、玉米(Zea mays )、高粱(Sorghum bicolor )、水稻(Oryza sativa )的D27基因序列为模板, 以
DNAman 软件分析D27保守区。用Primer5.0软件设计RT-PCR 引物(表1)。以cDNA 为模板, 使用全式金Trans Taq HiFi DNA Polymerase 进行RT-PCR, PCR 运行程序为94℃, 3 min 预变性, 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 45 s, 30个循环, 72℃延伸10 min 。PCR 产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测, 以全式金公司的凝胶回收试剂盒回收、纯化扩增条带, 并连接到pEASYTM-T5 Zero-Vector 载体中, 转入DH5α大肠杆菌, 阳性克隆经PCR 鉴定后, 送上海生工测序, 测序结果经Blast 和DNAman 6.0验证比对分析。
1.4 5'和3'端的RACE 克隆
根据1.3中的甘蔗ScD27基因同源片段序列设计内外巢基因特异性引物(表1)。按照Clontech Smart Race cDNA Amplification Kit 说明书扩增目的基因的3'和5'末端。以拼接获得的全长序列为模板, 设计引物扩增ScD27基因的编码区序列, 扩增条件为94℃, 3 min 预变性, 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 45 s, 30个循环, 72℃延伸10 min 。参见1.3的检测、回收、测序、验证比对分析。
表1 RT-PCR 、RACE 、荧光定量PCR 扩增引物
珍肽Table 1 Primers used for RT-PCR, RACE, and Q-PCR experiments
引物名称 Primer name
引物序列
Primers sequence (5'–3')
目的 Purpose
ScD27EST-F CTGGGATGAAGAACGGAAA ScD27EST-R GCTGCTTCAGTGCTGGATCA 基因片段扩增
Amplification of gene segment 外侧特异引物ScD27-5'R2 CGAGCCAAGGGAAGAATATCGTGGTGAA 内侧特异引物ScD27-5'R1 CGTAGCCGTCCTTTCCGTTCTTCATCCCAG 5' RACE 扩增 5' RACE amplification 外侧特异引物ScD27-3'F1 GCCGCCTTCACCACGATATTCTTCCCTT 内侧特异引物ScD27-3'F2 GGAATCCGAAGTTGATGGAAGGAAAGAG 3’RACE 扩增 3' RACE amplification ScD27F CGACGCACGCACGGAGT
ScD27R ACTAGAATTGCCTTCTGCTATGTT
编码区扩增
Amplification of coding region D27-Q547F ATGTGAGGTCAGGGAATCCGAAG D27-Q694R TGAATCTTGGATGAACTTCTGGCA 实时荧光定量PCR 扩增 Amplification of q-PCR GAPDHF CACGGCCACTGGAAGCA
GAPDHR TCCTCAGGGTTCCTGATGCC GAPDH 内参基因
GAPDH reference genes
1.5 甘蔗ScD27基因的生物信息学分析
使用ORF Finer 在线工具寻编码框; ProtParam (/ProtParam/)和Smart (smart. embl-heidelberg.de/)在线软件分析蛋白的基本理论性质和保守结构域; ProtScale 分析蛋白质疏水性; SignalP4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM Sever2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)和PSORT (psort.hgc.jp/)分析蛋白的信号肽和亚细胞定位预测; SOPMA 软件预测蛋白的 二级结构; NCBI 平台进行Blast 同源比对分析,
ClustalW 软件进行多序列对齐和排序, MEGA5.0构建NJ 系统进化树。
1.6 甘蔗ScD27基因表达的实时荧光定量PCR 分析
取甘蔗的分蘖芽、腋芽、茎尖、根尖、老根、嫩叶、老叶(第四叶中段)、节(第三节)和叶鞘, 提取RNA (方法参考1.2)。根据ScD27基因序列设计荧光定量PCR 引物, 使用GAPDH 作为内参基因[46](表1)。选用TaKaRa 公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒,
34
作 物 学 报 第43卷
按其说明书, 定量PCR 体系20 μL, 用ABI Vii7Real time PCR System (Applied Biosystems, USA)检测ScD27基因的表达。设置3个重复样品, 利用2–ΔΔCT 法计算基因的相对表达量[47]。
2 结果与分析
2.1 甘蔗ScD27基因全长cDNA 序列
图1所示, RT-PCR 扩增得到长度为477 bp 的甘蔗D27基因片段; RACE 扩增获得479 bp 的3'端序列和670 bp 的5'端序列。通过将中间片段、3'端序
列和5'端序列拼接, 得到全长为1379 bp 的甘蔗D27基因全长cDNA 序列, 使用编码区引物扩增获得867 bp 的编码区序列。该基因包含127 bp 的5'非编码区、385 bp 的3'非编码区和867 bp 的编码区, 可编码288个氨基酸, 被命名为ScD27, 并将基因序列提交GenBank 数据库, 登录号为KP987221.1。
2.2 甘蔗ScD27的生物信息学分析
2.2.1 ScD27蛋白基本理化性质和保守结构域分析
通过ORF Finer 在线工具到ScD27的ORF 框, 并翻译成氨基酸序列(图2)。使用ProtParam 在线软
图1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1
Agarose gel electrophoresis of PCR products
图2 ScD27基因的编码区序列及推导出的氨基酸序列
Fig. 2 Leotide and predicted amino acid sequences of ScD27 gene
第1期
吴转娣等: 甘蔗独脚金内酯生物合成关键基因ScD27的克隆与表达分析 35
件分析该蛋白序列的理化性质表明, ScD27蛋白的分子式为C 2539H 4205N 867O 1033S 255, 分子量为71.58 kD, 等电点为5.04, Ala 、Pro 、Ser 在氨基酸序列组成中出现频率较高, 分别占10.1%、9.4%、7.3%和8.1%, 而一些氨基酸如Pyl 、Sec 在氨基酸序列中则没有出现。稳定性系数为50.16, 表明为不稳定蛋白(不稳定系数<40是稳定蛋白, >40是不稳定蛋白); 总平均亲水性(GRAVY)为–0.308, 脂肪系数(AI)为68.79, 说明该蛋白质亲水区域多于疏水区域, 为亲水蛋白。
通过Smart 分析表明甘蔗ScD27蛋白在氨基酸序列第190~234之间可能含有一个ZnF_TAZ 锌指结构域, 在氨基酸序列第199~224之间有一个类ZnF_A20锌指结构域, 由于具有相同结构的蛋白往
往行使相似的功能[48], 因此推测ScD27蛋白可能参与了其他生物学通路, 与植物调节分蘖来响应非生物胁迫有关。
2.2.2 ScD27蛋白磷酸化和糖基化位点 蛋白质的修饰方式包括蛋白质的磷酸化和糖基化, 它可以调节蛋白质的活力和功能。分别运用DictyOGlyc 1.1 Server 和NetPhos 2.0 Serve 在线软件预测ScD27基因翻译后磷酸化、O-糖基化修饰情况。结果显示, ScD27蛋白有可能发生磷酸化修饰的位点有16个, 其中氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)可能发生磷酸化修饰的位点分别有8、5、3个(图3); 有可能发生O-糖基化修饰的位点有0个(图4)。磷酸化位点均集中分布在中间亲水区。
图3 ScD27蛋白氨基酸序列翻译后磷酸化修饰位点预测华硕易pc
Fig. 3
Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of ScD27 protein7.22事件
图4 ScD27蛋白氨基酸序列翻译后O-糖基化修饰位点预测
Fig. 4 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequence of ScD27 protein
2.2.3 ScD27蛋白信号肽预测、亚细胞定位和蛋白的二级结构预测 根据SignalP4.1 server 软件预测
可知, 该蛋白的信号肽平均值较小, 为0.217 (远远小于0.500), 因此推测ScD27蛋白无信号肽及切割位点, 属于非分泌蛋白, 说明该蛋白在细胞质中合成后不能被转运。根据PSORT II 在线软件预测表
明ScD27蛋白主要定位于叶绿体上。使用SOPMA 软件预测ScD27蛋白的二级结构(图5), 该蛋白α-螺旋(h)占33.6%、β-折叠(e)占14.24%、β-转角(t)占4.86%和无规则卷曲(c) 47.22%。可见α-螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分, 进一步分析发现α-螺旋在N 端与中部所占分量较大, 延伸
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