浙江农业学报Ata Agriculturae Zhejiafgeosis,O0O1,33(1):6O-68htty：//cww.zjnyxb 王伟科，陆娜，闫静，等.秀珍菇S-腺昔甲硫氨酸合成酶基因(PpSAMS)的克隆与表达分析[J]•浙江农业学报,2021,33 (1)：6O—68. DOI：10.3969//issn.1004A524.2021.01.08
秀珍菇+腺＞甲硫氨酸合成酶基因（PpSAMS）的克隆与表达分析
王伟科，陆娜，闫静，宋吉玲，袁卫东，周祖法
（杭州市农业科学研究院，浙江杭州0-0024）
摘要：在对不同生长阶段的秀珍菇样品进行高通量转录组测序的基础上，经分析筛选获得S-腺昔甲硫氨酸合成酶全长基因（PpSAMS））为了探究PpSAMS在低温刺激后秀珍菇原基形成过程中的功能与表达差异，从秀珍菇中克隆得到了PpSAMS基因，对其进行了系统分析，并利用实时荧光定量PCR的方法，分析该基因在低温刺激后原基形成过程中不同生长发育阶段的表达情况）生物信息学分析表明,PpSAMS基因全长由115O个核昔酸组成，编码384个氨基酸，具有蛋氨酸腺昔转移酶活性，并具有结合ATP、金属离子的功能）氨基酸序列系统进化树分析结果显示,PpSAMS基因编码蛋白与糙皮侧耳亲缘关系最近。经实时荧光定量PCR 检测，该基因在菌丝体经低温诱导后恢复至室温时期（原基形成前期）表达量最高，推测其有可能在诱导真菌DNA甲基化并促使原基形成过程中起到重要作用） 关键词：秀珍菇'克隆'实时荧光定量PCR；S-腺昔甲硫氨酸合成酶基因'表达分析
中图分类号:S646文献标志码:A文章编号:1004-1524（2021）01A062内7
Clocing and expressioc acalysis of PpSAMS gecr of Pleurotus pulmonarius
WANGWeike,LUNa,YANJing,SONGJiaing,YUANWeidong,ZHOUZuea
（Hangzhou Academy cf Agricultural Ocieoces,Haogzhfh310024, China）
Abstract:Based on the high-throughput Ranscriptome sequencing of dTferent growth stages of Pfurotus puanonaRus sampaes,theQu-aength geneoQ S-adenosyamethioninesynthetasewasobtained byanaaysisand sceeening.In oedeeto explore the function and expression dPerence of PpSAMS in the formation of pypordium of Pfurotus puAonaOus after low temperature sPmuUtion,the gene of PpSAMS was cloned and analyzed systematically in order to explore the function and expression dTference of PpSAMS in the primordium formation of Pfurotus pulAonaTim after low temperature sPmuUtion.The expression of the gene in dPerent growth stages was analyzed by real tirne fluorescence quanti-tativNPCR.BioineoematicsanaaysisshowNd that PpSAMS gNnNwascomposNd oe1152nucaotidNsa
nd NncodNd384 aminoacids.Ithad theeunction oebindingATPand metaaions,and had theactivityoeS-adenosyamethioninesyn-thetase.Thephyaogeneticteeeanaaysisoeaminoacid sequenceshowed thatthepeotein encoded by PpSAMS genewas closely related to Pfurotus osPeatus.Real time auorescence quantitative PCR indicated that the expression of PpSAMS was the highest when the mycelium recovered to room temperature after low temperature induction（prophase of pypordium formation）.It might play an ipportant role in the process of DNA methylation and primordium formation, and participate in the development of fruiting body.
收稿日期:2020-04-17
基金项目：浙江省农业（食用菌）新品种选育重大科技专项（2016C02057）
作者简介：王伟科（1981—），男，浙江宁海人，学士，高级农艺师，主要从事食用菌育种与栽培技术研究）E-mail：*************
王伟科，等.秀珍菇S-腺昔甲硫氨酸合成酶基因(PpPAMS#的克隆与表达分析・63・Key words:Pleurotue pulfonariui；clone；reel Pme tuorescenco quanti/tive PCR；PpSAMS；expression analysis
秀珍菇(Pleurotue pulfooagm)在分类学上属于担子菌I'1、伞菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属的大型真菌［1］，其口感极好，味道鲜美，纤维含量少，热量低，肉质脆爽，且营养丰富，蛋白质含量极高，同时还含多醯、纤维素、矿物质素、氨基酸与多种微量元素等，被验证具有抗肿瘤的功能，是一种价值极高的珍稀食用菌［2］)秀珍菇抗逆性较强，生产周期较短，出菇整齐，产量可观，应用工厂化设施进行规模化栽培已成为其生产的主要方式［3］)生产上秀珍菇采用低温诱导调控出菇的方法，了解秀珍菇低温诱导下原基形成的分子机理，对秀珍菇工厂化栽培具有重要的指导意义⑷。
课题组前期对秀珍菇低温诱导后样本与原基形成前期的样本进行了转录组测序，并分析了样本间的差异表达基因，经转录组测序后IA为Cluster-6377-69422的基因在秀珍菇菌丝体经低温刺激后原基形成前期样本中高度表达，经基因注释与Swbsprvt描述，其编码S-腺昔甲硫氨酸合成酶，将其命名为PpSAMS。
S-腺昔甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethi-oninesynthetasa,SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶，它催化ATP和甲硫氨酸反应生成的S-腺昔甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine,SAM)，是重要的甲基供体，也是生物合成多胺和乙烯等的前体，能够参与植物的转氨丙基、转甲基和转硫等多种重要的生化反应过程［5-7］。同时，SAMS 还可以与RNA结合参与基因的表达调控研究表明,SAMS基因与植物对干旱、盐碱和低温的抗性密切相关，并协助植物耐受非生物胁迫，提高植物抗逆性［9-11］o此外，不同植物SAMS基因或同一物种的不同家族成员之间的表达模式具有明显的组织和时间特异性%12一
⑷，表明不同的SAMS基因可能参与了不同的生理代谢过程。因此，分物种的SAMS基因，
基因的功能具有重要意义。
目前已经在番茄%15&、拟南芥%13&、松树［16］等多种生物中克隆了SAMS基因，但还未见秀珍菇SAMS基因(PpSAMS)相关报道。本实验利用生物信息学技术分析筛选出该基因的全长序列，设计引物克隆了该基因，并对其进行了相关分析，为进一步深入研究该基因奠定了基础，同时为阐秀珍菇刺激诱导基与子成的分子机理提供参考。
1材料与方法
1-1供试材料
1.1.1供试菌株
供试菌株为秀珍菇5766，由临安鼎新农业科技有限公司提供。
1.1.2基质配方
基质配方为：棉籽壳39%、木屑39%、获皮18%、石膏1%、石灰1%。
1.1.3样本处理金年华教育系统
菌包接种后于26~28°C条件下避光培养，待菌丝满袋后，选取生长状态一致的菌包开展试验。分4组取样，每组10包，分别记为S0、S1、S2、S3。S0，菌丝满袋后，用银子挑取发菌良好的菌包料面纯菌丝体10g，置于-80C超低温冰箱'S1，满后，良的包10C 条件下12h，按S0方法取样保存;S2，菌丝满袋后，发菌良好的菌包置于10C条件下12h，再待其恢复到室温状态后，按S0方法取样保存;S3，原基形成期取原基10g，保存方法与S0—致。1.2试验方法
1.2.1总RNA的提取
样本总RNA的提取采用TOzoi法进行［17］，样本经液氮研磨后TOzoi裂解，离心弃沉淀，上清加入氯仿/异戊醇抽提，振荡混匀。离心后上清加入体积比1：1的异丙醇，沉淀总RNA O沉淀经75%乙醇洗涤后溶于40DEPC水中。
1.2.2cDNA的合成
总RNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳与Nanv-dop2000c检测纯度和浓度后，参考Biorad公司的iScOpi cDNA Synthesis Kii合成cDNA。
1.2.3基因克隆
根据秀珍菇测序结果，选取PpSAMS基因。同时运用引物设计软件POmeo5.0设计相关引物如下：上游引物5fATGTTCTCCATCCGCATCTCC-
-64-浙江农业学报第33卷第1期
3'；下游引物5,-3GCCCATCAAACTCCTCTAA-3,。
以反转录后cDNA为模板进行PCR扩增，共
50反应体系：10x胪缓冲液5.0^L,50
mmol•L_1MgSO41.0»L,25mmol•L_1dNTP2.0
jjl L,10mmol•L-1上游引物2.0»L,10mmol•L"1
下游引物2.0!',cDNA模板5.0咽,Pfv DNA
Polymeose1.0!',ddH2O32»L。
反应条件为：94C预变性4min；94C40s,
54C40s,72C1min,30;72C
伸7min。扩增产物用PCR产物胶回收试剂盒直
接纯化回收。连接T载体后转化大肠埃希菌，提
取质粒DNA进行鉴定，阳性克隆送北京擎科生
物技术有限公司测序。
1.2.4基因的生物信息学分析
在htt y：//bi.v/blasi*h-g
tp：///、/ww.unit
<等相关网址进行生物信息学分析。采用
软件VecWrNTI、MEGA5.0对序列进行多重比对，
并构建系统进化树［18］。
1.2.5基因表达分析
分别提取秀珍菇常温处理菌丝体、低温诱导
后菌丝体、低温诱导原基形成前期菌丝体与原基
4个不同处理阶段总RNA，参考iScOpt cDNA
Synthesis Kb进行cDNA第一链的合成，同时根据
测序后的PpSAMS序列设计引物，按照SYBR
Premia Ex TaqTM H使用说明，检测基因PpSAMS
张生伟
的表达，以A c U p作为内参，计算PpSAMS的相对
表达豊19］)目的基因和内参基因Actir的退火温
度均为53C，样品设3个重复。引物见表1。
2结果与分析
2.1PpSAMS基因克隆与生物信息学分析
为研究PpSAMS基因信息并探究其功能，通
表1实时荧光定量PCR反应引物序列
Table1Primers for reel Pme tuorescenco quantPat/e PCR
引物名称POmer name
物
P imeRsequence(5'-3')
PpSAMS-F GCAACAATCTCCTGATATTGC PpSAMS-R GACGAAGCGGCCAGAGGGTTG Actin-F CGTTCATTGCCGACGGTGATG Actin-R CTCTGAACCCCAAGGCAAACC 过利用RTNCR技术从秀珍菇中克隆得到1100 bp的DNA段，克隆后，通ORF Findeo寻其开放读码框，显示为1个全长为1152bp的ORF框，推断其为编码384个氨基酸的功能蛋白。
BLAST显示其与密黏褶菌(Goeophyllum trabe-um)S-腺昔甲硫氨酸合成酶基因"S-adenosylmethb onine adenosyltransferase,GenBank:XM_007864819.1)相似度为83%。
与GenBank中登录的基因进行同源性比较和功能预测分析后，获得序列被验证确认为一个编码384个氨基酸的CDS(Coding sequenca，图1)。Vectvo NTI软件推算该编码蛋白的相对分子
41.8ku。
2.2PpSAMS基因编码蛋白系统进化分析
利MEGA5.0件秀珍菇PpSAMS基因基分，秀珍菇PpSAMS编码的蛋白与糙皮侧耳同源蛋白亲缘关系最近，与其他真菌同源蛋白的亲缘关系较远(2)。
2.3PpSAMS的GO功能分析
神秘搭车人GO功能分析显示，PpS4MS蛋白具有结合ATP、金属离子的功能，同时具有S-腺昔甲硫氨酸成酶性。GO分, PpSAMS参与了甲硫氨酸、单碳的代谢过程，同时参与了S-腺昔甲硫氨酸的生物合成。S-腺昔甲硫氨酸在甲基转移中是一个重要的甲基供体，并可以将DNA甲基化，从而调控基因的表达。可见，Pp-S4MS蛋白在秀珍菇DNA甲基化调控过程中起要作。
装配式公路钢桥
2.4PpSAMS的KEGG分析
KEGG pathway分析显示,S-腺昔甲硫氨酸合成酶催化：甲硫氨酸形成S-腺昔甲硫氨酸，后者参与了生物体内的一系列代谢过程，包括乙烯合成与的谢(3)。
2.5低温诱导后秀珍菇不同生长阶段PpSAMS 的表达研究
PpS4MS在秀珍菇菌丝体常温处理(S0)、低温诱导(S1)、低温诱导后原基形成前期(S2)、原基期4个不同生长阶段均有不同程度的表达。其中S1阶段PpSAMS的相对表达量高于S0阶段，说明菌包受到低温胁迫后,PpSAMS 的表达量有一
王伟科，等.秀珍菇SA泉昔甲硫氨酸合成酶基因（PpSAMS#的克隆与表达分析・65・
1MSLAPGHFLFTSESVGEGHP
1ATGTCTTTGGCTCCTGGTCACTTCCTCTTCACTTCTGAGTCTGTCGGCGAGGGTCACCCT 21DKICDQVSDAILDACLAQDP
61GATAAGATTTGTGATCAAGTCTCGGACGCCATCCTCGATGCTTGCTTGGCTCAGGATCCC
41FSKVACETASKTGMIMVFGE
121TTCTCCAAGGTTGCTTGCGAGACCGCCTCGAAGACCGGCATGATCATGGTTTTCGGAGAA 61ITTKALIDYQKVIRETIKQI
181ATTACGACCAAGGCCCTCATTGACTACCAGAAAGTCATTCGTGAGACCATCAAGCAGATT
中房指数81G Y D D S SKGFDYKTCNI L V A I
241GGCTACGATGACTCGTCGAAGGGCTTCGACTACAAGACTTGCAACATTCTTGTCGCCATT
101EQQSPDIAQGLDHGSLEDLG
301GAGCAACAATCTCCTGATATTGCTCAGGGGCTGGACCACGGTTCGCTCGAGGACCTTGGT
121AGDQGIMFGYATDETEEYMP
361GCTGGTGACCAGGGTATCATGTTCGGTTATGCCACCGACGAGACGGAGGAGTACATGCCT
141LTVVLAHKLNAAMAVARRSG
421CTGACTGTCGTGCTCGCGCACAAGCTCAACGCCGCTATGGCCGTTGCCCGCCGCTCCGGT
161ALPWLRPDSKTQVTIEYKKD
481GCTCTCCCATGGCTCCGACCTGACTCCAAGACTCAAGTCACCATTGAGTACAAGAAGGAC
181G G A T I PLRVDTVVVSTQHAE
541GGTGGTGCCACCATCCCCCTCCGTGTCGACACCGTTGTTGTCTCTACCCAGCACGCCGAA
201EISTEDLRKELLEKVVKKVI
601GAAATCTCCACTGAGGACCTCCGCAAGGAACTCCTGGAGAAAGTTGTCAAGAAAGTCATC
221PAHLLDDRTVYHIQPSGRFV
661CCCGCTCACCTTCTCGACGACCGAACTGTCTACCACATCCAACCCTCTGGCCGCTTCGTC
241IGGPQGDAGLTGRKI I V D T Y
721ATCGGTGGACCCCAGGGTGATGCCGGTTTGACTGGTCGTAAGATCATTGTCGACACCTAC
261GGWGAHGGGAFSGKDFSKVD
781GGTGGATGGGGTGCCCATGGTGGAGGTGCTTTCTCTGGAAAGGACTTCTCAAAGGTCGAC
281RSAAYTARWIAKSLIAAGLA
841AGATCTGCTGCTTACACCGCCCGCTGGATTGCCAAGTCTCTCATTGCTGCTGGCCTCGCC
301RRALVQLSYAIGVAQPLS I H
901CGCCGCGCACTCGTACAACTCTCCTATGCCATCGGTGTCGCTCAACCGCTGTCCATTCAC
321VDTYGTGKKSDEDLVEVIRN
961GTTGACACCTACGGCACAGGCAAGAAGTCCGATGAGGACCTTGTCGAAGTCATCCGTAAC
341NWDLRPGVIVQELGLQKPQY
1021AACTGGGATCTCCGACCTGGTGTGATTGTCCAGGAACTCGGTCTCCAAAAGCCACAATAC 361LKTASYGHFGNPEYSWEKPK
1081CTCAAGACCGCCTCCTACGGCCACTTCGGCAACCCCGAGTACTCCTGGGAGAAGCCCAAG 381P L K L*
1141CCCCTCAAGCTCTGA
图1PpSAMS基因的ORF读码框与翻译结果
Fig.1ORF and transcription of PpSAMS
绒毛栓菌(77mmerespubesce/7s)
白腐菌(77mmeres versicolor)
球果栓菌(Trametes coccinea)
伏令(Wolfiporia cocos)
密黏褶菌(Gloeophyllum trabeum)
秀珍菇(Pleurotus pulmonarius)
糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)
真姬菇(Hyps/'zygus marmoreus)
纹缘盔抱菌(Gm/er/Tia marg i n a ta')
绿斑裸伞(Gymnopilus dilepis)
腐烂真菌(Phlebia cent r i f ug a)
肝牛排菌(片stulina hepatica)
裂褶菌(Schizophyllum commune)
粉抱革菌(Coniophora puteana)
图2PpSAMS基因氨基酸序列系统进化树
Fig.2Phylogenetic tree of amino acid sequence of PpSAMS between Pleurotut puAonoRus and other fungi
・66・浙江农业学报第33卷第-期
L-高半胱氨酸
L-Homocystei ne
S-腺昔甲硫氨酸S-Ade no syl-
—L-methi onine
S-腺昔-高半胱氨酸
S-Ade no syl-Q-
L-homocysteine 八
| 2.1.1.5 ||2.1.1.10|
|2.1.1.13||2.1.1.14|
3.3.1.1
|441.2l|
|2.1.1.37||~2.1.1.~ |
]3.2.2.9 |----------S- D-核糖基- L-同型半胱氨酸O N-酰基- L-高丝氨酸内酯S-D-RibosyI-L-homocysteinet N-Acyl-L-homoserine lactone
/■-甲硫氨酸
S-腺昔甲硫氨酸合成酶.——
L-Methionine S-Adenosine methionine l 4-4-1 ~14
syn thetase
1-氨基环丙烷-1-竣酸盐
1 一A mino cyclopropa ne-1 -carboxvlate
■|23.1.184[-S-甲基-5，硫代腺昔
S-Methyl-5,
-thioade nosine
丙酸代谢
Propanoate metabolisnr^
S-腺昔硫基丙胺12.5.1.22
图3 PpSAMS 基因KEGG 代谢通路分析
Fig. 3 KEGG pathway analysis oC PpSAMS
定程度的升高；而S2阶段PpSAMS 的相对表达量
高于S0与S1阶段，说 PpSAMS
程的 诱导后，启动 某些生理生化反应，诱导原基形成（图4）。
O 6UELP
P O
丄
SO
S1
S2 S3
样品名称Sample
图4 PpSAMS 在秀珍菇不同生长阶段的表达情况
Fig. 4
Expression profile oC PpSAMS in Pleurotue 卩机^吨-
Oue at dbferent growth stages
3 讨论
出菇过程是大型食
生命过程中不
少的环节，在秀珍菇栽培研究中， 诱导刺激相关基因表达的调控能够
齐出菇%20&。因此，研究秀珍菇子 育分子机制
与发育 基因可为秀珍菇出菇技术提供指导, 也可为 种质资源 本遗传背景
筛选提供帮助% 21&。
担子菌子
成的分子机理研究
是外学者的研究热点，目前已分
到多
与食
的基因。香菇pt 基因在
期 表达， 基 子 育 成 的
期大量表达， 菇子 成中起到要作用%22&）金针菇原基形成 的HMGNvx 转录因子基因Fv-hmg 在金针菇原基时期的表达
高于双核 期， 转录因子参与
调控金针菇的原基形成%23&。本 与 研究 似， PpSAMS 在诱导秀珍菇原基
成过程中起到重要作用。
研究表明，植物与大型食 受低温
胁迫时，能够利 甲基化程度（甲基 去甲基化）的改变调控基因表达%24&。S 内泉昔甲硫氨
成酶催化甲硫
ATP 形成S 内泉昔甲硫
，SN 泉昔甲硫
甲基转移中是一个重山东师范大学招聘
要的甲基供体，并 DNA 甲基化， 影响基因的表达%25&。本研究中PpSAMS 基因在秀珍
菇受 诱导后表达 升， 属 的
应激反应，提高了秀珍菇 抗低温能力；同
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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