作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1290−1293/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal
基金项目: 中国博士后科学基金项目(20060390773); 河南省教育厅自然科学基金项目(2006210007)
作者简介: 康国章(1971–), 男, 从事作物分子生理研究; 王永华(1973–), 男, 从事作物生理研究。**共同第一作者。灵通英语第一册
*通讯作者(Corresponding author): 郭天财(1953–), 博士生导师, 从事作物生理研究。E-mail: gmzx-guo@371 Received(收稿日期): 2007-10-22; Accepted(接受日期): 2008-01-24.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01290
康国章**王永华**刘超沈丙权郭天财*朱云集
(河南农业大学国家小麦工程技术研究中心, 河南郑州450002)
摘要: 从大粒型小麦品种豫教2号中克隆出调控小麦ADPG焦磷酸化酶(AGPase)胞质型大亚基基因(LSU I)cDNA
全长。在花后15 d的小麦植株中, 通过半定量PCR法, 发现LSU I基因在叶、籽粒、叶鞘和颖壳中表达量较高, 但 在根和茎中表达量较低, 表明在绿光合功能器官和淀粉合成器官中, LSU I基因量表达较高。比较了LSU I基因在 千粒重不同的豫教2号和兰考矮早八两小麦品种籽粒发育过程中的表达差异后, 发现在籽粒形成期, LSU I基因在两
品种籽粒内表达相似, 但在籽粒灌浆期和成熟期间, LSU I基因在千粒重较高的豫教2号内表达量明显高于千粒重较
低的兰考矮早八, 这个表达差异与两品种间淀粉积累差异趋势相似, 表明LSU I基因的表达量可能与淀粉的积累量
密切相关。
关键词: 小麦; AGPase胞质型大亚基; 基因克隆; RT-PCR; 基因表达
Cloning and Expression of AGPase Cytoplasmic Large Subunit Gene in Common Wheat
KANG Guo-Zhang**, WANG Yong-Hua**, LIU Chao, SHEN Bing-Quan, GUO Tian-Cai*, and ZHU Yun-Ji (Engineering Research Center for Wheat, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China)
Abstract: The 1941-bp full cDNA sequence (GenBank No. DQ839506) of LSU I, the cytoplasmic large subunit gene I of adenosine 5' diphosphate glucose pyrophosphorylase (AGPase), was cloned from a high 1000-grain weight wheat (Triticum aestivum L.) cultivar Yujiao 2. Semi-quantitive PCR analysis showed that LSU I expressed higher in leaves, glumes, sheaths, and grain than in roots and stems, indicating that LSU I expressed actively in photosynthetic and starch synthesis-related organs. During the primal period of grain development (5–10 d after thesis), there was no difference i
n transcript levels of LSU I gene between Yujiao 2 and Lankao Aizao 8 (low 1000-grain weight), but the transcript amounts in grains of Yujiao 2 was markedly higher than that of Lankao Aizao 8 at grain filling and maturity stages. The changes of LSU I gene expression were similar to the trend of starch accumulation in the two cultivars, suggesting that LSU I gene may be associated with starch accumulation in common wheat.
Keywords:Triticum aestivum L.; Cytoplasmic large subsuit gene I of AGPase; Gene cloning; RT-PCR; Gene expression
小麦的产量由单位面积穗数、穗粒数和千粒重三要素构成。近年来, 随着育种和生产水平的提高, 一大批高产与超高产小麦品种不断出现。但一些品种, 尤其是大粒型品种因受遗传及植株生育后期环境因素(“干热风”等)的影响, 籽粒的充实度较低, 产量下降, 品质变劣。淀粉占小麦籽粒库容重的70%~80%, 是其充实度与千粒重的决定因素, 因此提高籽粒的充实度应从提高籽粒内淀粉的合成积累入手[1-2]。
AGPase是淀粉合成关键酶[3], 分为胞质型(I)与质体型(II)两种, 均是由成对的2个大亚基和2个小亚基构成的异源四聚体。大亚基可能是AGPase活性的调节中心, 而小亚基可能是催化中心[4]。玉米质体型大亚基(LSU II)突变体(Sh2)籽粒内AGPase活性下降90%~95%, 淀粉含量降低75%左右[5] , 表明LSU II亚基在AGPase活性中起重要作用。Smidansky等[6]把玉米LSU II基因转入小麦后, 使LSU II基因高表达, 发育中的籽粒AGPase活性明显上
第7期康国章等: 小麦AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析1291
升, 单株粒重平均增加38%, 整株生物产量也显著提高。Sakulsinghavoj等[7]把具有高活性的大肠杆菌AGPase基因的大亚基(经序列比较为LSU II)导入水稻, 发现当外源LSU II基因在胞质中表达时, 转基因水稻内AGPase活性上升13倍, 粒重增加11%, 产量显著提高。
目前, 对胞质型大亚基(LSU I)在作物籽粒淀粉合成过程中的调控作用尚未见报道。本研究从小麦籽粒中克隆LSU I全长(GenBank登录号: DQ839506), 并比较了它在小麦植株不同部位及籽粒发育不同时期的表达状况, 旨在分析该基因在调控小麦籽粒淀粉合成中的作用, 并为下一步通过转基因提高小麦籽粒淀粉积累量与千粒重奠定基础。
1材料与方法
1.1植物材料
选用千粒重不同及淀粉含量差异较大的两个大粒型小麦品种豫教2号(千粒重较大)和兰考矮早八(千粒重较小), 2006—2007年生长季种植于河南农业大学科教示范园区。试验地状况及管理同文献[8]。2006年10月15日播种, 两品种开花期均为2007年4月22日, 2007年5月29日收获。
1.2 LSU I的克隆
在豫教2号灌浆中期(花后20 d左右), 取0.5 g幼嫩籽粒置液氮中, 研磨至粉末状, 用Trizol(Sigma公司)提取总RNA。参照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(MBI公司)操作步骤合成cDNA。
根据GenBank中LSU I基因的核苷酸序列(Z21969和X67151)设计1对引物, Sense primers为5′-CTTCCCTG CATTTGATTGA-3′; Antisense primers为5′-CTCGCTGC CACTTCTTTAC-3′, 由北京奥科生物技术有限公司合成。
PCR扩增体系含10× PCR缓冲液3 μL、10 mmol L−1 dNTP 0.6 μL、10 μmol L−1引物各1 μL、2 U mL−1Taq DNA 聚合酶 0.5 μL、cDNA模板1 μL、无菌双蒸水21.9 μL。PCR扩增程序为95℃变性5 min; 95℃50 s, 56℃ 1 min, 72℃ 2.5 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。
将获得的LSU I全长经T4(MBI公司)连接酶与pMD20-T(大连宝生物公司)连接后, 转化大肠杆菌DH5α(湖南农业大学作物基因工程省重点实验室提供), 经菌落PCR和质粒酶切鉴定为阳性的单克隆进行测序。
将上述阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司进行测序。测序结果在NCBI数据库(bi.nlm. v/blast/) 上进行同源性比较分析。
1.3 LSU I的表达分析
取花后15 d左右豫教2号植株, 分别提取其根、茎、叶、叶鞘、颖壳和籽粒的RNA, 合成cDNA, 并对LS
U I 进行扩增。通过半定量PCR法, 对此基因在植株不同部位的表达进行分析。
在初花期, 挂牌标记两品种同一天开花的植株, 花后每5 d取标记的穗样, 提取其发育籽粒中的RNA, 采用半定量PCR法, 比较两品种间LSU I的表达差异。用β-Actin作对照基因(AB181991), 其扩增引物Sense primers 为5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′; Antisense primers为5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′, 扩增片段长度为422 bp左右。
1.4籽粒淀粉含量与蛋白质含量的测定
按1.3节中测定LSU I在籽粒发育不同时期的取样方法。取样后剥下标记穗样上的籽粒, 于105℃烘箱中杀青10 min, 80℃烘干后待测。采用双波长法测定直链、支链和总淀粉含量[9]。直链淀粉含量测定主波长为620 nm, 参比波长为430 nm, 支链淀粉含量测定主波长为540 nm, 参比波长为720 nm, 总淀粉含量为直链淀粉与支链淀粉含量之和。采用半微量凯氏定氮法[10]测定蛋白质含量。
2结果与分析
2.1 LSU I的克隆与序列分析
以特异引物对豫教2号进行扩增, 得到2.0 kb左右的DNA片段(图1)。此片段的大小与预计扩增的LSU I大小相近, 对此片段亚克隆后进行测序。测序结果表明(图2), 小麦LSU I cDNA全长为1 941 bp (GenBa
终极篮徒nk登录号: DQ839506)。序列比较结果显示, 该cDNA序列与小麦的Z21969有99%同源性, 与大麦的X67151有94%同源性, 与大麦的X67151有94%同源性, 与玉米的AY104549有84%同源性, 与水稻的AK100910有83%的同源性, 表明克隆出了小麦LSU I基因的cDNA序列(表1)。与同源性最高的Z21969相比, 编码域内有2个碱基的不同(图4), 即848 bp处的C(Z21969为T) 和923 bp处的A(Z21969为G), 但不影响其编码的氨基酸(图2)(同源性比较略)。
图1豫教2号籽粒LSU I基因cDNA全长扩增的电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of LSU I gen
e from grains of
common wheat cultivar Yujiao 2
Lane 1: LSU I gene; M: DL2000.
2.2 LSU I在小麦植株不同部位的表达
图3显示, 花后15 d LSU I的表达量在叶、籽粒和叶鞘中较高, 在颖壳中次之, 在根和茎中较低。
1292
作 物 学 报 第34卷
图2 克隆的小麦胞质型大亚基基因LSU I (DQ839506)的核苷酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequence of cloned wheat LSU I (DQ839506) from grains of Yujiao 2 cultivar
起始编码子和终止编码子, 以下画线标出, 与Z21969序列比对有差异碱基以阴影表示。
Start and stop codons are underlined. The different bases between LSU I and Z21969 are emphasized with shadows.
表1 LSU I (DQ830506)和其他基因的同源性比较
Table 1 Homologous comparison between cDNAs encoding LSU I (DQ839506) from common wheat and genes from other crops
Gene name
Accession number
Identity (%)
Triticum aestivum AGP-L gene
Z21969 99 H. vulgare ADP-glucose pyrophosphorylase X67151 94 Zea mays PCO103001 mRNA sequence
AY104549
84
Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA clone: J023132J11
AK100910 83
图3 LSU I 在小麦植株不同部位的表达 Fig. 3 Transcripts of LSU I gene in different organs of wheat
plants
2.3 LSU I 基因在籽粒不同发育阶段的表达分析
图4表明, LSU I 基因在两品种籽粒不同发育阶段的表达总趋势相似。在花后5 d 表达量较弱, 10 d 达到高峰, 之后开始下降。籽粒内LSU I 基因的表达, 在花后5~10 d 的籽粒形成期, 两品种无明显差异; 但在灌浆期和成熟期间(花后15~35 d), 豫教2号下降较慢, 一直维持在较高水平; 而兰考矮早八下降较快, 前者明显高于后者。
图4 豫教2号和兰考矮早八花后籽粒内LSU I 基因的表达 Fig.4 Transcripts of LSU I gene in grains of Yujiao 2 and Lankao
Aizao 8 after anthesis
兰考矮早八的千粒重为43.60 g, 豫教2号为57.02 g, 豫教2号比兰考矮早八高30.78%, 表明两品种间籽粒的内容物积累量有较大的差异(表2)。小麦籽粒内容物主要由淀粉和蛋白质组成, 其中淀粉约占干重的65%~80%, 蛋白质约占干重的10%~20%[1]。两品种间蛋白质含量无显著
表2 兰考矮早八和豫教2号千粒重、蛋白质和总淀粉含量的差异
Table 2 Differences of 1000-grain weight and contents of protein and starch between Lankao Aizao 8 and Yujiao 2 品种 Cultivar
千粒重
1000-grain weight (g)
蛋白质含量 Protein content (%) 总淀粉含量 Starch content (%) 豫教2号 Yujiao 2
57.02±0.46 a 12.56±0.11 a 67.07±3.36 a 兰考矮早八 Lankao Aizao 8
43.60±0.38 b
13.32±0.13 a
56.61±2.18 b
表中数据为4次重复的平均值±标准差。数据不同字母表示品种间达显著差异。
Data in the table are mean ±SD of four replicates. Values followed by a different letter are significantly different at P ＜0.05.
第7期康国章等: 小麦AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析1293
图5兰考矮早八和豫教2号花后籽粒内总淀粉的积累量
Fig. 5 Starch accumulation in grains of Lankao Aizao 8 and Yu-
jiao 2 after anthesis
差异, 籽粒内容物含量的差异主要来自于总淀粉含量。花后籽粒淀粉的积累与LSU I的表达相似, 在花后5~10 d 的籽粒形成期, 两品种无明显差异, 但在随后的籽粒灌浆期和成熟期, 豫教2号明显高于兰考矮早八(图5), 表明两品种籽粒发育中后期淀粉积累量的差异导致其最终籽粒内容物含量的不同。雄心飞扬
3讨论
在小麦、水稻等禾本科植物的胚乳中, AGPase主要为胞质型, 其催化生成ADP葡萄糖的反应大多在胞质中发生。因此与质体型大亚基(LSU II)相比, 研究胞质型大亚基(LSU I) 意义更重要, 而目前有关作物淀粉合成关键酶—AGPase的基因工程研究主要集中在LSU II上[6-7,11]。本文克隆了小麦LSU I的cDNA全长, 为通过转LSU I基因来提高小麦籽粒内淀粉的积累奠定了基础。
淀粉的合成积累主要在光合作用器官(淀粉暂时性贮藏器官)和籽粒(淀粉永久性贮藏器官)中进行[12]。LSU I 在叶片、叶鞘、颖壳等光合作用较强的器官和淀粉积累器官—籽粒中表达量较高, 而在含光合能力较低的茎和根部表达较低(图3), 表明LSU I可能在淀粉合成与积累中起重要作用。在籽粒形成期, LS
U I在豫教2号和兰考矮早八两品种籽粒内的表达无明显差异, 但在淀粉合成积累的关键时期—灌浆期与成熟期, 在千粒重较高的豫教2号籽粒内表达量明显高于兰考矮早八(图4, 图5)。LSU I 在两品种间的表达差异与两品种间淀粉积累的差异相似, 这更进一步表明, LSU I在淀粉合成中发挥着重要作用。本研究克隆了小麦LSU I基因cDNA全长, 下一步的工作是利用该cDNA序列, 构建过表达载体, 并把它转到淀粉含量与千粒重较低的小麦品种中, 以提高灌浆期间LSU I 的表达, 提高AGPase活性及增加灌浆期间籽粒淀粉积累量, 为通过基因工程提高小麦产量开辟一个新途径。References
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