基因克隆是分⼦⽣物学中的⼀种基本的操作⽅法。通过双酶切来构建载体是其中常⽤的⼀种⽅法，这种⽅法利⽤限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，⽤两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因⽚段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作⽤下进⾏连接，从⽽实现基因克隆。但是在实际操作中经常会遇到酶切效率及连接效率不⾼等问题，致使靶基因⽚段插⼊载体相当困难，为此⼈们采取了多种策略进⾏克隆。最近开发了⼀种叫做同源重组的基因克隆⽅法，相⽐双酶切载体构建⽅法，该⽅法的构建过程有些不同。⾸先，靶基因⽚段扩增引物有别于常规引物设计；其次，载体切割过程中只需要进⾏单酶切；第三，载体和⽬的基因⽚段的连接是基于同源重组⽽不是粘性末端互补。 载体构建是分⼦⽣物研究常⽤的⼿段之⼀，整个过程包括⽬的基因扩增，载体和⽬的基因酶切，末端间连接，感受态细胞转化和阳性克隆的筛选，每⼀个步骤都必须严格控制其反应条件。
⼀、双酶切构建载体⽅法
新型功能材料民用建筑外保温系统及外墙装饰防火暂行规定双酶切构建载体⽅法⽐较繁琐。
⾸先，对引物的设计有着严格的要求，引物的长度⼀般为18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游死人手指
引物之间GC含量不能相差太⼤，引物中需要加⼊酶切位点及保护性碱基。引物设计不当可能在扩增时⽣成引物⼆聚体，给实验带来不便。
其次，⽬的基因有必要进⾏TA克隆。在后续的实验操作中，可能会由于酶切效率和连接效率低等原因使得载体构建相当困难，⽬的基因扩增在这些步骤之前，由于PCR扩增是体外扩增，很容易发⽣突变，TA克隆有着成功率⾼的优点，通过TA克隆将⽬的基因构建进pMD 19T进⽽转化⼊⼤肠杆菌中，单克隆菌体⾃⾝的修复机制可保证单⼀的克隆，利于筛选需要的序列，通过后续测序鉴定可以得到⼤量正确的⽬的基因⽚段，⽽且直接将PCR产物切下来不易产⽣粘性末端，连接⼊表达载体⽐较困难，通过TA克隆酶切的⽬的⽚段产⽣粘性末端的概率很⾼。
第三，双酶切效率不⾼。由于不同的酶所对应的缓冲液不同，内切酶只有在最适的缓冲液环境下效率才能得到最优化，但是双酶切体系势必使其中⼀个酶的活性有所损失。这样必定会使酶切产物不纯。酶切产物中既有单酶切线性载体，也有双酶切线性载体，使得连接时所需要的双酶切线性载体的量失准，影响连接效率。因此可以先⽤⼀个限制性内切酶切割纯化回收，但⼯作量较⼤，回收率低。
第四，连接效率低。pMIR reporter与⽬的⽚段的摩尔⽐很重要，⼀般在3:1-10:1间浮动，⽽且连接效率和连接反应体积也有关系。
⼆、同源重组法构建载体
透明国际
采⽤同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体⽅法不同。
⾸先，设计引物时上游引物5’端前⾯加的是酶切位点（如Hind III）及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应前⾯的15个碱基载体⽚段，下游引物5’端前⾯加的是Hind III酶切位点及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应后⾯的15个碱基载体⽚段，如此设计引物是为了保证⽬的⽚段插⼊载体时⽅向正确。
其次，载体只需要单酶切，⽤Hind III酶切pMIR reporter，使得pMIR reporter成为两端都带着Hind III位点的线性载体。相⽐双酶切切割载体，单酶切可以保证酶切后的载体都是单⼀的线性⽚段，使得后续的重组连接更准确。爱安海
第三，省去了TA克隆环节。因为PCR产物可以直接⽤于重组连接，不需要酶切产⽣粘性末端，⽽且重组酶的重组能⼒强于T4 DNA连接酶的连接能⼒，⼀般只需要⼀步即可重组连接成功，因此可以在重组反应之后进⾏测序鉴定。刘谷来
总之，两种⽅法各有利弊，双酶切构建过程⽐较繁琐，同源重组构建过程相对简单，可以省去很多的时间和精⼒，但假阳性率略⾼。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议