库克曲线
刘雅婷;杨爱军;杨丽;李双明;向琳;刘燕菲;李敏
【摘 要】目的 观察低氧微环境对结肠癌细胞增殖、侵袭及自噬的影响,探讨低氧对结肠癌细胞生存及与自噬的关系.方法 免疫磁珠分选CD133+细胞;Boyden小室实验研究结肠癌细胞的侵袭;透射电子显微镜(TEM)观察细胞的超微结构;MDC荧光检测自噬囊泡;联合运用流式细胞仪和锥虫蓝染研究自噬与细胞增殖的关系.结果 Boyden小室实验中低氧微环境增加结肠癌细胞SW480进入下室的细胞数量;在实验组低氧的微环境中SW480细胞的MDC荧光强度由20.53±0.64降低至17.00±0.20,而CD133+细胞的MDC荧光强度由19.89±0.58增加至33.13±1.95(P＜0.05).锥虫蓝染实验显示,与对照组相比,低氧微环境中SW480活细胞率随着时间的延长而降低(P＜0.05):但CD133+活细胞率无显著改变.结论 低氧可增加SW480细胞的侵袭性,细胞自噬水平下降,活细胞率降低;CD133+细胞在低氧微环境中自噬的发生增加,活细胞率基本不变.%Objective To observe the effects of hypoxic microenvironment on the proliferation, invasion and autophagy of colon cancer cells and to investigate the relationship between survival and autophagy of colon cancer cells under hypoxic conditions. Methods CD 133 + cancer stem cells (cancer stem cells, CSCs) were purified using MACS (magnetic activated cell-sorting system) CD 133 + cell isolation kit. The invasion of colon cells was measured by Boyden chamber. The ultrastructure was observed using transmission electron microscope (TEM). The autophagy vesicles were detected by monodansylcadaverin ( MDC) fluorescence. The relationship between autophagy and cell survival was analyzed using flow cytometry together with trypan blue staining. Results In Boyden chamber, the amount of SW480 moving into the second floor was increased under the hypoxic microenvironment. In experimental groups that were exposed to hypoxic conditions, the MDC fluorescence intensity of SW480 cells rndecreased from 20. 53 ± 0. 64 to 17. 00 ± 0. 20, while that of CD133 + CSCs increased from 19. 89 ± 0. 58 to 33. 13 ± 1. 95 ( P <0. 05) . The trypan blue staining showed that under hypoxic conditions, the viability of SW480 cells decreased significantly over time (P <0. 05 ) , while that of CD133 + cells had no significant changes. Conclusions For SW480 cells, the invasion may be enhanced under the hypoxic microenvironment, with both the level of autophagy and viability decreased. For CD133 + cells, the occurrence of autophagy increased under the hypoxic environment, with the viability basically unchanged.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2012(032)010
【总页数】6页(P1143-1148)
【关键词】柴油抗磨剂低氧;自噬;结肠癌;CD133+
【作 者】刘雅婷;杨爱军;杨丽;李双明;向琳;刘燕菲;李敏
【作者单位】兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃兰州730000;兰州军区总医院病理科,甘肃兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,甘肃兰州730000;甘肃省新药临床前研究重点实验室,甘肃兰州730000
京九铁路电气化改造【正文语种】中 文
【中图分类】R73
肿瘤在宿主中生长，需要宿主提供更多的O2，肿瘤生长的速度远远大于支持它的物质［1］。在此过程中虽然有拟态血管的形成，但肿瘤血管的结构及功能都存在异常，因此氧气和营养物质都相对缺乏，在实体瘤中经常会出现低氧的现象。然而肿瘤细胞却可以在这种微环境中继续生存，特别是一具有干细胞特性的CD133+细胞(cancer stem cells，CSCs)。
自噬的发生会形成双层膜的自噬体，之后与溶酶体结合，分解胞质中的大分子及细胞器［2］。起初认为自噬同凋亡及细胞坏死一样作为细胞的死亡形式，之后有研究表明自噬为一种新的细胞保护机制以促进肿瘤细胞存活，尤其是在低氧及缺血的微环境中。自噬会因细胞系的不同及肿瘤生长的不同阶段发挥不同的作用。本实验拟研究低氧微环境对结肠癌细胞生存的影响并观察其与自噬之间的关系。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
结肠癌细胞系SW480由本实验室提供，常规培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基
中，置于37℃、5%CO2饱和湿度下培养，每2天换液传代。将细胞置于氧气含量控制在1%，94%N2及5%的CO2。
1.2 免疫磁珠分选
取10瓶对数生长期结肠癌SW480细胞(细胞数为107个)，胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入300 μL的缓冲液缓冲(0.5%BSA 2 mmol/L EDTA 0.01%PBS)重悬，再加入FCR阻断剂及CD133磁性微珠(Miltenyi公司)各100 μL，充分混匀，置于4 ℃ 暗处避光孵育30 min。加入10～20倍细胞体积的缓冲液洗涤，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入500 μL的缓冲液缓冲重悬。将MS分选柱安装在磁性分选架上，加0.5 mL缓冲液后润洗分选柱将细胞移入MS分选柱中，并加入4倍体积的缓冲液，细胞悬液流出(此时为CD133－细胞)。当液体停止流出时，将分选柱移出分选架，用配套的塞子快速的将剩余液体压入瓶中，此时得到CD133+细胞。
1.3 CD133+细胞体外培养
将分选后的细胞接种于培养瓶中，加入含2%B27、20 μg/L bFGF、20 μg/L EGF 的 DME
M/F12 培养基，每3天加液1次，分别于分选后0、7和14 d倒置显微镜观察细胞生长情况。
1.4 锥虫蓝染
称取4 g锥虫蓝，少量去离子蒸馏水研磨，加双蒸水至100 mL，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4%。胰蛋白酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混合混匀(终浓度0.04%)。在3 min内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝，而活细胞拒染，呈无透明状。活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。
1.5 Boyden小室实验
在Boyden小室的下室中加入200 μL的完全培养液，两室之间放一张孔径为8 μm的多聚碳酸酯膜，膜上均匀铺浓度为3 000 g/L的胶原50 μL，将小室放入37℃、5%CO2聚合30 min。细胞用胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，每个上室内加入浓度为1×105个细胞悬液200 μL，置于对照组正常O2和实验组1%O2的微环境中孵育24及48 h，实验终止后常规HE染，在200倍光镜下每张膜计数5个视野的穿膜细胞数，计数平均数。各组重复3次。
1.6 电镜观察
用胰蛋白酶消化收集对照组正常O2和实验组1%O2的 SW480细胞，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，PBS冲洗3次，每次5 min，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，氧化丙稀浸润，环氧树脂包埋并制成切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染，透射电镜观察并摄片。
1.7 MDC荧光检测自噬囊泡
用胰蛋白酶消化，培养基反复吹打并收集细胞，加入50 μmol/L MDC 37 ℃、5%CO2孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，95% 乙醇固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，加入5 μmol/L PI 室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min，通风处晾干后，使用倒置荧光显微镜(NiKon)观察并摄片。
1.8 自噬的流式细胞术定量分析
以MDC染法后，细胞用95%乙醇固定，流式细胞仪以488 nm激发波长，测定MDC染的荧光强度。
1.9 统计学分析
所有数据采用SPSS16.0统计软件进行处理，组间差异比较采用方差分析，所有指标以均数±标准差(±s)表示。天然气利用政策
2 结果
2.1 低氧微环境(1%O2)对结肠癌细胞生存的影响美帝国的崩溃电子书
2.1.1 CD133+细胞体外培养:免疫磁珠分选法得到CD133+细胞，大小均一，圆形，散在分布，悬浮不贴壁。无血清培养48 h后可见部分细胞成团生长，72 h后可形成较小的细胞球，7 d后细胞球逐渐生长，体积变大，14 d时细胞球数量增多且体积增大，半贴壁生长(图1)。
2.1.2 低氧微环境对结肠癌细胞侵袭的影响:SW480细胞在1%O2微环境中24及48 h的穿膜细胞数显著高于常氧(P＜0.05);另外在不同时间相同微环境中48 h穿膜的细胞数显著高于24 h(P＜0.05)(表1)。
2.1.3 低氧对结肠癌细胞活细胞率的影响:与对照组相比，低氧微环境中SW480细胞的活细胞率随着时间的延长而降低(P＜0.05);但对CD133+细胞的活细胞率无显著改变(表2)。
图1 CD133+细胞体外生长情况Fig 1 Growth and proliferation of CD133+CSCsA.CD133+CSCs grew in serum-free medium after isolated by magnetic activated cell sorting(×100);B.cultured for seven days，CD133+CSCs grew in serum-free medium and had a bit of small sphere-like cells(×200);C.cultured for fourteen days，CD133+CSCs grew in serum-free medium and had lots of larger sphere-like cells( ×200)
表1 低氧对结肠癌细胞侵袭的影响Table 1 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+invasion at 24 and 48 hours(±s，%，n=3)*P＜0.05 compared with SW480(21%O2)24 hours;#P＜0.05 compared with SW480(21%O2)48 hours.48 hours SW480 71.00±6.56 134.33±10.50 91.33±6.81* 270.33±10.51 group 21%O224 hours 21%O248 hours 1%O224 hours 1%O2#9.27 CD133+ 43.67±11.24 59.67±4.51 52.00±13.75 56.67±2
表2 低氧对结肠癌细胞活细胞率的影响Table 2 Effect of hypoxia on SW480 and CD133+
viability at 24 and 48 hours(x ±s，%，n=3)*P＜0.05 compared with SW480 control group.48 hours SW480 86.93±1.99 68.93±3.17* 61.00±1.10 group control 1%O224 hours 1%O2*CD133+88.23±2.04 85.73±2.29 84.30±1.14
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