转录因子Relish在斑节对虾不同发育阶段的表达分析 刘文静;杨丽诗;杨其彬;李晓兰;苏天凤;江世贵
夏日原野上的追赶
【摘 要】三腔二囊管对克隆获得的转录因子NF-κB/Rel家族成员Relish基因在斑节对虾发育阶段的表达特征进行分析.所获的PmRelish是Relish基因的亚型之一,与凡纳滨对虾LvRelish高度相似,结构域组成相同.其中RHD、IPT和DD结构域均具有100％的同源性,ANK结构域的相似性也高达97.7％.NF-kB/Rel家族进化树分析显示,PmRelish与对虾、昆虫等节肢动物的Relish聚为一支,并与P105(NF-κB1)和P100(NF-κB2)最为相近.PmRelish的表达在4个幼体发育时期都存在显著性差异,其中糠虾阶段表达量最高.PmRelish在不同发育阶段的精巢和卵巢中的表达特征相似,即未成熟期的表达相对较低,其中PmRelish在10～12 cm体长雄虾精巢中表达量最高,卵巢中的表达则在成熟期(V期)最高,为卵原细胞期的14.3倍. 【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2012(039)012
【总页数】烟台的海教学设计5页(P3-7)
大冶钢
【关键词】中国化学会斑节对虾;NF-κB/Rel;Relish;发育阶段;荧光定量PCR
【作 者】刘文静;杨丽诗;杨其彬;李晓兰;苏天凤;江世贵
【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东广州510300;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东广州510300;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东广州510300
【正文语种】中 文
【中图分类】Q785;S945.4+7
斑节对虾（Penaeus monodon）是对虾属中最大型种，广泛分布于东半球，是甲壳类最重
要的经济种类之一。 目前，虽然斑节对虾亲虾全人工培育、全人工育苗和健康养殖技术都已经取得突破并不断完善，然而其生长发育机理仍未十分清楚，尤其对亲虾繁殖过程中的细胞调控机制仍缺乏了解。
机体的生长、发育、成熟是一个复杂的过程，受多个基因、多条信号通路的共同调控。 核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB) 最早发现于鼠 B 淋巴细胞核中[1]，是一种重要的核转录因子。 已知的NF-κB/Rel 家族包括8个成员：RelA（P65）、c-Rel、RelB、P105（NF-κB1）、P100（NF-κB2）、Dorsal、Dif、Relish。 与 NF-κB 结合的 IκB 受泛素化降解后，NF-κB 通过 N 端的 Rel 同源结构域（RHD）二聚化，随后通过翻译后修饰作用被进一步激活，并进入细胞核，与目的基因启动子或增强子序列κB 位点发生特异性结合，进而参与调控这些基因的转录和表达。 NF-κB广泛参与机体的免疫应答、细胞增殖和分化、细胞凋亡、生长发育等重要病理和生理过程[2-4]。
果蝇 NF-κB 因子 Dorsal、Dif 和 Relish 被发现在胚胎发育过程中，对建立背腹轴模式起中心调控作用，随后发现三者也参与了体液免疫反应[5-6]。 最近，一些重要养殖无脊椎动物中也相继发现了NF-κB/Rel 家族成员[7-12]。我们首次从斑节对虾中获得NF-κB/Rel 家族成
员之一Relish，并克隆其 cDNA 全长。 目前，转录因子 NF-κB 家族的研究主要集中在免疫学和癌症生物学领域，而该类重要免疫基因如何参与生长发育调控的研究少见报道，本研究对斑节对虾不同发育阶段以及不同性腺发育阶段中，Relish 基因的表达变化模式进行分析，初步显示斑节对虾Relish 基因在斑节对虾生长发育过程中可能起着重要的调控作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试健康斑节对虾来于南海水产研究所热带水产研究开发中心（三亚、陵水），养殖在25～30℃的充气循环海水池中。 所取样品包括无节幼体、蚤状幼体、糠虾、仔虾时期虾全体；个体生长到 7～8、10～12、15～16 cm 的雄虾精巢以及按黄建华等[13]划分的卵巢6 期各期样品。样品均剪碎后保存于 RNAlater（Ambion）。
1.2 试验方法
1.2.1 序列分析 使用DNAstar 对PmRelish 的氨基酸序列进行预测，蛋白结构域分析用NCBI 结构分析工具（http：//bi.v/Structure/i） 和 SMART
4.0（http：//bl-heidelberg.de/）程序；扩增序列同源性比对和相似性搜索采用NCBI 网站上的BLAST 程序（http：//bi.v/）； 采用 Clustalx 1.81 软件和 MEGA 5.0 软件，以邻位相连（Neighbor-joining，NJ）法构建系统进化树。
1.2.2 RNA 的提取和cDNA 的合成 RNA 提取方法参见 Trizol 说明书（Invitrogen）。 提取的 RNA 经琼脂糖凝胶电泳确定其完整度，用NanoDrop 2000/2000c 分光光度测定其浓度和纯度。每个样品取1 μg RNA 进行逆转录。使用TaKaRa 公司的PrimeScript R RT 逆转录试剂盒进行。 总RNA 经42℃孵育2 min 后去除基因组DNA，随即37℃孵育15 min 进行第1 链 cDNA 合成。
1.2.3 实时荧光定量PCR 将不同样品cDNA 稀释1 倍作为模板，采用SYBR GreenⅠ染料法在Eppendorf 荧光定量PCR 仪上进行扩增和数据分析。 依照TaKaRa SYBRR PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行 PCR 反应。 反应体系为 20 μL，包含 10 μL 的 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，1 μL 稀释的模板，各 0.4 μL 正、反引物（10 μmol/L）及 8.2 μL 的 ddH2O。 每个样品 3 次重复。 反应程序：95℃预变性 10 s，95℃变性 15 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 40 个循环。
信号发生器设计 使用引物PmRelish-F 和 PmRelish-R 扩增目标基因（表1），PmEF-F 和PmEF-R 扩增 EF-1α 基因作为内参（表1），试验数据采用相对 CT 法（2-ΔΔCT 法）分析 PmRelish 在各样品中的相对表达量。
运用统计学软件SPSS16.0 进行相对独立的单因素方差分析，结果值以平均值±标准差（x±SD）表示。
表1 试验中所用引物序列引物名称PmRelish-F PmRelish-R PmEF-F PmEF-R引物序列(5＇→3＇)ATGAGAATGATCGGGAGGTA TGTCAGGCATGAATGTGAAGT AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT CGTGGTGCATCTCCACAGACT
2 结果与分析
2.1 PmRelish蛋白结构预测
研究结果表明，本研究获得的斑节对虾Relish 基因全长5 112 bp，包括3 561 bp 的ORF 片段，推测编码1 186个氨基酸的蛋白 （GenBank 登录号：JQ728539）。 SMART分析显示，PmRelish 氨基酸序列具有NF-κB/Rel 家族的典型结构，包含一个保守的N 端的Rel 同
源结构域1（Rel homolog domain 1，RHD1)，一个 Ig-样 plexin 转录因子结构域 （IPT 结构域，或称 RHD2），一个核定位信号NLS，一个 C 端 IκB 样结构域（6 个 ankyrin 重复）以及一个 C 端的死亡结构域 （death domain，DD，图1）。 参照NCBI 结构域分析工具与SMART4.0 分析的结果，将已报道的对虾Relish 基因进行结构分析比较（图1），结果显示PmRelish 蛋白包的氨基酸残基数与LvRelish 基本相当，结构域特征相同，其中的RHD、IPT 和DD 结构域具有100%同源性，ANK 结构域的相似性高达97.7%（表2）。 但与中国明对虾 Relish（FcRelish）的差异较大，后者只包含RHD1 和IPT 结构域，其与PmRelish 的同源性相对较低，分别为86.4%和 84.6%（表2）。 FcRelish 与凡纳滨对虾短小型 Relish（sLvRelish）的类似，缺少 ANKs 和DD 结构域。
图1 对虾Relish 蛋白结构比较RHD：Rel 同源结构域；IPT：Ig-样 plexin 转录因子结构域；ANKs：锚定蛋白重复；DD：死亡结构域。黑线长短代表氨基酸残基数的数量
表2 斑节对虾与其他对虾Relish 蛋白结构域同源性比较其他对虾Relish LvRelish（ACJ36224.1）sLvRelish（ACR24222.1）FcRelish（ABR14713.1）同源性（%）RHD 100.0 100.0 86.4 IPT 100.0 100.0 84.6 ANK 97.7 DD 100.0
2.2 NF-κB /Rel家族蛋白的进化树分析
用邻位相连法构建了NF-κB/Rel 家族蛋白的系统进化树，结果（图2）显示不同物种的同种NF-κB/Rel 家族成员可被较好地区分。 其中斑节对虾Relish 先与凡纳滨对虾Relish 聚为一支，而后与中国明对虾、桑蚕Relish1聚在一起，最后与果蝇的Relish 聚为一大支。 Relish 分支与P100、P105 分支，以及玻璃海鞘和紫海胆的NF-κB 最为相近。 其次，依次与 RelA、c-Rel、RelB、Dorsal、Dif 依次远离。
图2 NF-κB/Rel 家族蛋白进化树构建进化树的氨基酸序列来自斑节对虾、凡纳滨对虾〔Litopenaeus vannamei Dorsal （ACJ36225.1）〕、中国明对虾〔Fenn eropenaeus chinensis Dorsal（ACJ36225.1）〕、长牡蛎〔Crassostrea gigas Rel1（AAK72690.1）〕、玻璃海鞘〔Ciona intestinalis NFkB、（NP_001071772.1）〕、紫海胆〔Strongylocentrotus purpuratus NFkB（AAD08653.1）〕、刺参〔Apostichopus japonicus Rel（AEP33643.1）〕、圆尾鲎〔Carcinoscorpius rotundicauda NFkB （AAZ40333.1）〕、黑腹果蝇〔Drosophila melanogaster Dorsal（AAA28479.1），Dif（AAA 28465.1），Relish（AAF20137.1）〕、拟暗果 蝇〔Drosophila sechellia Rel（XP
_002031947.1）〕、烟 草 天 蛾 〔Manduca sexta Dorsal（ADK 39025.1）〕、桑 蚕 〔Bombyx mori Relish1（BAF74125.1）〕、斑 马 鱼〔Danio rerio P100（NP_001001840.2）〕、原鸡〔Gallus gallus c-Rel（NP_001161198.1），P100（NP_989744.1）〕、小鼠〔Mus musculus RelA（AAF82405.1），RelB（NP_033072.2），c-Rel（NP_033070.2）〕、食蟹猴〔Macaca fascicularis P65（EHH56082.1）〕、人类〔Homo sapiens RelA （AAH33522.1），RelB （NP_006500.2），c-Rel（CAA52954.1），P105（AAO30127.1），P100（AAH02844.1）〕
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