文章编号：1001-8689(2021)04-0332-07
收稿日期：2020-07-22
基金项目：湖南省自然科学基金(No. 2017JJ3173)；湖南省人民医院仁术基金(No. 2016)
作者简介：姜斌，女，生于1992年，在读硕士研究生，主要从事临床微生物的致病机理及耐药机制的研究工作，E-mail:****************
变身宝贝*
鄱阳湖经济区通讯作者：E-mail:*****************
血流感染中分离的耐甲氧西林溶血葡萄球菌的药物敏感性、
姜斌1 彭娜1 周海健2 付陈超3 欧阳鹏文1 谢良伊1,*
(1 湖南省人民医院(湖南师范大学附属第一医院)检验科，长沙 410005；2 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京
102200；3 中南大学湘雅医院感染控制中心，长沙 410008)
摘要：目的 调查分析本地区血流感染中分离耐甲氧西林溶血葡萄球菌(MRSH)的药物敏感性、葡萄球菌盒染体mec (SCC mec )分型及分子流行病学特征。方法 收集2013年1月1日—2014年12月31日湖南省20家三甲医院血流感染患者的MRSH 78株，采用微量肉汤稀释法进行体外药敏试验；PCR 扩增mecA 基因及SCC mec 基因；脉冲场凝胶电泳(PFGE) 检测MRSH 的同源性。结果 78株MRSH 中，96.1%的菌株存在mecA 基因，MRSH 对红霉素、左氧氟沙星和克林霉素的耐药率分别为94.9%、80.7%和53.8%，2株对利奈唑胺耐药，1株对拉宁耐药，没有菌株对万古霉素耐药。SCC mec 可分型为50%(39/78)，不可分型为50%(39/78)。39株可分型菌株中，单个SCC mec 类型以Ⅰ型为主(18/39，46.1%)，混合型SCC mec 类型以Ⅰ+Ⅱ型为主(12/39，30.8%)。PFGE 带型整体较为分散，但有6组菌株间存在100%同源性。结论 本地区血流感染中MRSH 的耐药形势严峻；在SCC mec 可分型的菌株中，以Ⅰ型SCC mec 为主，SCC mec 多样且不同SCC mec 型别之间的耐药性存在差异；本地区MRSH 以散发为主，但存在院间及院内交叉感染的可能性，应加强对其监测，减少MRSH 的进一步传播。 关键词：溶血葡萄球菌；血流感染；耐药性；SCC mec ；PFGE 中图分类号：R978.1 文献标志码：A
Antimicrobial susceptibility, SCC mec typing, and homology analysis of methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus isolated from bloodstream infections
Jiang Bin 1, Peng Na 1, Zhou Hai-jian 2, Fu Chen-chao 3, Ouyang Peng-wen 1, and Xie Liang-yi 1
(1 Department of Clinical Laboratory, Hunan Provincial People’s Hospital (the First Affi liated Hospital of Hunan Normal University), Changsha 410005; 2 National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and
Prevention ，Beijing 102200; 3 Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008)
Abstract Objective To investigate and analyze the antimicrobial sensitivity, staphylococcal chromosome cassette mec (SCC mec ) typing and molecular epidemiological characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus (MRSH) isolated from bloodstream infections. Methods A total of 78 MRSH isolates were collected consecutively from bloodstream infection patients in 20 tertiary hospitals in Hunan province during 2013—2014. The antimicrobial sensitivity tests were performed in vitro using the microbroth dilution method. The mecA and SCC mec were amplified by PCR. All MRSH isolates were characterized by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Results Of the 78 MRSH strains, 96.1% had mecA gene. The resistance rates of MRSH to erythro
mycin,
血流感染是导致全球住院患者高发病率和病死率的主要原因[1]。凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci, CNS)在院内血流感染中发挥重要的作用。溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus, SH)在血流感染中分离率位居CNS第二，仅次于表皮葡萄球菌[2]。SH在CNS中具有最高水平的抗生素耐药性，且大多数发展为多重耐药菌株[3]。近几十年来，随着抗菌药物的广泛应用，耐甲氧西林溶血葡萄球菌(methicillin-resistance Staphylococcus haemolyticus, MRSH)的检出率不断增加，并且传播、流行、进化的速度加快，为人类健康带来了巨大的威胁。甲氧西林耐药与葡萄球菌盒染体mec(staphylococcal chromosome cassette mec, SCC mec)元件上携带的mecA有关[4]。SCC mec元件是一种可移动的遗传元件，能在菌株间进行水平转移，这种水平转移的特征被认为是引起葡萄球菌对抗生素耐药增加的原因之一[5-6]。
本地区关于血流感染中MRSH的SCC mec的研究较少。本研究对湖南省20家医院血流感染中MRSH 的药物敏感性、SCC mec分型及同源性作出分析，为临床提供诊断与的依据。
1 资料与方法
1.1菌株来源
收集2013年1月1日—2014年12月31日湖南省20家三甲医院血流感染患者的MRSH共78株，均为各医院临床科室分离出的非重复菌株。菌株使用MALDI-TOF MS(VITEK MS，法国Bio-merieux公司)进行进一步鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 8739。
1.2体外药敏试验
体外药敏试验包括12种临床常用抗菌药物(苯唑西林、头孢西丁、红霉素、克林霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑、四环素、万古霉素、利奈唑胺、替加环素和拉宁)。头孢西丁采用纸片扩散法，其余采用标准肉汤微量稀释法测定MRSH的最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration, MIC)。除替加环素参照美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FAD)折点标准外[7]，其余均参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)折点标准[8]。头孢西丁纸片法和肉汤微量稀释法的质控菌株分别为粪肠球菌ATCC 29212、金黄葡萄球菌ATCC 29213和金黄葡萄球菌ATCC 25923。药敏结果中苯唑西林MIC值≥0.5μg/mL且头孢西丁抑菌圈直径≤24mm判定为MRSH。
1.3mecA基因及SCC mec基因检测
采用PCR对mecA基因进行扩增，对SCC mec基因进行分型检测，引物合成参照已报道的文献[9-10]。PCR 扩增体系：2μL DNA悬液作为PCR扩增模板，引物F/R各1μL，2×Easy Taq PCR supermix 15μL，
ddH2O 11μL，总反应体系为30μL；反应条件为95℃预变性5min , 94℃变性30s , 72℃退火1min, 72℃延伸5min , 35个循环。阳性条带用sanger测序验证。对于SCC mec 不能分型的菌株，通过已报道的文献中描述的方法检测菌株的mec复合体(class A mec、class B mec)和ccr基因复合体(ccrAB1、ccrAB2、ccrAB3和ccrC)的类别[10-11]。
1.4分子分型和同源性分析
采用脉冲场凝胶电泳(p u l s e d-f i e l d g e l electrophoresis, PFGE)进行分子分型及同源性分析。PFGE关键参数：使用浊度仪(Bio-Merieux公司)调整吸光度6.0~7.0；吸取150μL细菌悬液，加入4μL溶葡球菌酶(1mg/mL)，37℃孵育裂解30min，再加入等量的 1% SeaKemGold(瑞士Lonza公司)混匀倒入模具制作胶块；通过25μL蛋白酶K裂
levofloxacin, and clindamycin were 94.9%, 80.7% and 53.8% respectively, two strains were resistant to linezolid, one strain was resistant to teicoplanin, and no strain was resistant to vancomycin. The results of SCC mec genotyping showed that SCC mec can be classified as typeable (50%, 39/78) and untypeable (50%, 39/78). Among the 39 genotypeable strains, type I was the main type of single SCC mec (18/39, 46.2%), and type Ⅰ + Ⅱ was the main type of mixed SCC mec (13/39, 30.8%). The PFGE banding patterns were scattered as a whole, but there were 100% homology among six group
s of strains. Conclusion The situation of drug resistance of MRSH in bloodstream infections in this area is serious. Among the strains that can be typed by SCC mec, type I SCC mec is dominant. SCC mec is diverse and drug resistance is different among different SCC mec types. MRSH in this area is mainly sporadic, but there is the possibility of inter-hospital and intra-hospital cross infections, and thus surveillance should be strengthened to reduce the further spread of MRSH.
Key words Staphylococcus haemolyticus; Bloodstream infection; Resistance; SCC mec; PFGE
解菌体细胞；使用40U S m a Ⅰ(N E B 公司)进行酶切；在CHEF-MAPPER(Bio-Rad Laboratories 公司，美国)电泳仪中进行P F G E ；电泳参数为120°，6V/cm ，4.0~40.0s ，19h 。PFGE 图像录入BioNumerics(Version 7.1, Applied maths 公司，比利时)软件包进行处理。相似系数≥100%属于同一亚型。1.5 统计分析
使用SPSS 26.0(IBM Corporation ，Armonk ，NY ，USA)进行分析。采用χ2检验或费舍尔精确检验来确定不同SCC mec 型别与耐药率之间差异的显著性。如果P ＜0.05，为差异有统计学意义。2 结果
2.1 体外药敏试验与多重耐药模式
体外药敏结果显示对苯唑西林及头孢西丁耐药率为100%；对红霉素(74/78、94.9%)和左氧氟沙星(63/
78、80.7%)有较高的耐药率；其次为克林霉素(42/78、53.8%)，复方磺胺甲噁唑(27/78、34.6%)，四环素(22/78、28.2%)；对阿米卡星(2/78、2.6%)、利奈唑胺(2/78、2.6%)和拉宁(1/78、1.3%)有较低水平的耐药率；没有菌株对万古霉素及替加环素耐药(表1)。兰州铁路局
根据体外药敏试验，包括16种不同的多重耐药模式，如表2所示，例出7种主要的流行模式，其中以1型(甲氧西林-红霉素-克林霉素-左氧氟沙星)最为常见。其他9种耐药模式出现率不超过5%。2.2 mecA 基因与SCC mec 分型
在78株MRSH 中，PCR 扩增结果显示有3株菌mecA 基因阴性。50%(39/78)的菌株进行了分型鉴定，其中21株菌携带单个类型，包括SCC mec Ⅰ型18株(46.2%)，SCC mec Ⅱ型3株(7.7%)。18株菌携带2个
表3 78例MRSH 菌株不同SCC mec 类型与耐药性的相关性分析
免疫组化定量分析Tab. 3 Analysis of the correlation between different SCC mec types and drug resistance of 78 MRSH strains
SCC mec 类型红霉素/n (%)克林霉素/n (%)阿米卡星/n (%)左氧氟沙星/n (%)复方磺胺甲噁唑/n (%)
四环素/n (%)利奈唑胺/
n (%)拉宁/n (%)
Ⅰ(n =18)17(94.4)7(38.9)1(5.6)13(72.2)7(38.9)4(22.2)2(11.1)0Ⅱ(n =3)3(100)1(33.3)02(66.7)02(66.7)00Ⅰ+Ⅱ(n =12)10(83.3)6(50)010(83.3)2(16.7)7(58.3)00Ⅰ+Ⅲ(n =1)1(100)0000000Ⅰ+Ⅴ(n =1)1(100)001(100)0000Ⅱ+Ⅲ(n =2)2(100)1(50)02(100)01(50)00Ⅰ+Ⅱ+Ⅴ(n =1)1(100)1(100)0001(100)00Ⅰ+Ⅲ+Ⅴ(n =1)1(100)00001(100)00NT(n =39)38(97.4)26(66.7)1(2.6)35(89.7)18(46.2)6(15.4)01(2.6)P
0.829
0.33
0.997
0.034
0.35
0.026
0.554
0.998
表1 78株MRSH 的体外药敏分析结果
Tab. 1 Antimicrobial susceptibility analysis of 78 MRSH islates
抗菌药物敏感/n (%)
中敏/n (%)
耐药/n (%)苯唑西林0078(100)头孢西丁0078(100)红霉素4(5.1)074(94.9)克林霉素36(46.2)042(53.8)阿米卡星70(89.7)6(7.7)2(2.6)左氧氟沙星15(19.3)063(80.7)复方磺胺甲噁唑51(65.4)027(34.6)四环素54(69.2)2(2.6)22(28.2)万古霉素000利奈唑胺76(97.4)02(2.6)替加环素000拉宁
64(82.1)
13(16.7)
1(1.3)
表2 MRSH 菌株的主要多重耐药模式
Tab. 2 The main mode of multidrug resistance of MRSH strain
模式类型
耐药模式
株数/n (%)1甲氧西林-红霉素-克林霉素-左氧氟沙星14(17.9)2甲氧西林-红霉素-左氧氟沙星-复方磺胺甲噁唑10(12.8)
3甲氧西林-红霉素-克林霉素-左氧氟沙星-四环素
8(10.3)4甲氧西林-红霉素-左氧氟沙星
8(10.4)5甲氧西林-红霉素-克林霉素-左氧氟沙星-复方磺
胺甲噁唑
7(9.0)6甲氧西林-红霉素-克林霉素-左氧氟沙星-复方磺
胺甲噁唑-四环素
4(5.1)7
甲氧西林-红霉素-左氧氟沙星-四环素
dfm4(5.1)
或2个以上的混合型，包括Ⅰ、Ⅱ型混合型菌株12株(30.8%)，Ⅱ、Ⅲ混合型菌株2株(5.1%)，Ⅰ+Ⅲ，Ⅰ+Ⅴ，Ⅰ+Ⅱ+Ⅴ及Ⅰ+Ⅲ+Ⅴ型混合型菌株均为1株(2.6%)。39株不可分型的菌株中，未扩增到mec 复合体与ccr 复合体。MRSH 中不同SCC mec 类型的耐药性差异仅在左氧氟沙星(P =0.034)、四环素(P =0.026)有统计学意义(表3)。
菌株编号 分离日期 PEGE 型别116 2013.6.22 N0119 2014.7.29 N0134 2014.6.13 N0243 2014.6.11 N0260 2014.9.15 N0276 2014.12.8 N025 2014.3.12 N03137 2013.9.18 N043 2014.2.11 N04138 2013.9.11 N0439 2014.6.5 N0569 2014.6.21 N05112 2013.6.21 N08114 2013.6.4 N07114 2013.6.4 N08163 2013.9.13 N09115 2015.6.21 N102 2013.2.11 N10148 2013.12.20 N1190 2013.3.8 N121 2014.3.12 N1335 2014.6.19 N1422 2014.8.15 N1556 2014.9.20 N1673 2014.6.14 N1761 2014.12.19 N1811 2014.3.20 N18111 2013.6.9 N1936 2014.6.20 N2024 2014.8.19 N218 2014.3.14 N2272 2014.6.8 N23101 2013.3.9 N24106 2013.6.16 N25147 2013.12.7 N26104 2013.6.14 N27100 2013.2.7 N2864 2016.12.11 N2978 2014.12.21 N3087 2013.12.13 N3180 2014.3.11 N32154 2013.6.17 N33129 2013.6.6 N3479 2014.3.20 N3515 2014.6.7 N3653 2014.6.23 N3725 2014.6.13
N38103 2013.6.20 N3962 2014.12.13 N4014 2014.6.18 N4133 2014.6.12 N42139 2013.9.7 N4358 2014.12.20 N4452 2014.6.24 N4577 2014.12.21 N46140 2013.9.17 N4765 2014.9.3 N48146 2013.9.16 N49155 2013.12.16 N50158 2013.9.22 N5157 2014.12.18 N52119 2013.6.21 N5345 2014.6.10 N5423 2014.8.19 N5568 2014.6.15 N56143 2013.9.16 N5759 2014.9.16 N58151 2013.6.11 N5982 2014.9.16 N60150 2013.9.11 N6118 2014.7.17 N6240 2014.6.6 N63105 2013.6.5 N6432 2014.6.14 N65108 2013.6.11 N66110 2013.6.12 N67147 2013.9.10 N6888
2013.12.21 N69
60 65 70 75 80 85 90 95 100
图1 78株MRSH 菌株的PFGE 分析图
Fig. 1 Phylogenetic tree of MRSH by PFGE analysis
2.3 PFGE 分子分型
对所有MRSH 菌株进行了PFGE 分析，PFGE 图谱由10~12条带组成，其大小在20~500kbp 之间。78
株菌中共有69个带型，分别命名为N01~N69，分为63个亚型，无优势型别。69个带型的相似性系数在60%~100%之间(图1)。大部分相同PFGE 型别或亚型
型，其次为SCC mec Ⅰ+Ⅱ型。这项研究结果与Singh 等[5]的结果相似，他们的研究结果表明从血流感染中分离的SH 主要以SCC mec I 型为主。相比之下，Oliveira 等[18]研究表明，SCC mec Ⅲ型在SH 中占主导。Pereira 等[19]曾报道SCC mec Ⅱ在SH 中占主导。多项研究表明SCC mec V 型在SH 中占主导[17,20-21]。不同国家及地区出现不同的SCC mec 型别证实了SCC mec 类型与地理位置、环境、物种来源有关。据报道，在耐甲氧金黄葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA)中，SCC mec Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型多与医院获得性MRSA(hospital-acquired MRSA,HA-MRSA)相关，SCC mec Ⅳ、Ⅴ型多为社区获得性MRSA(community-associated, CA-MRSA)相关[22]。本研究中MRSH 主要为SCC mec Ⅰ型，而SCC mec Ⅳ及Ⅴ型少见，可能以HA-MRSH 为主。有研究表明，由于SCC mec IV 的小分子量而有利于移动，可能会导致携带SCC mec IV 型的菌株更容易传播，引起更高的感染率[19]。虽然我们的菌株中未分离出SCC mec IV 型，但也需要加强对SH 的监测。对MRSH 中不同类型SCC mec 对抗菌药物的耐药性进行分析，发现不同型别的SCC mec 与耐药性的差异仅在左氧氟沙星(P =0.034)、四环素(P =0.026)有统计学意义。而Machado 等[6]研究表明，SCC mec III 型菌株对抗生素的耐药性更高，耐药性的增加仅对克林霉素(P =0.021)、利福平(P =0.010)和左氧氟沙星(P =0.005)有统计学意义。
CNS 中SCC mec 大量不可分型元素以的存在给SCC mec 分型带来了巨大的挑战。SCC mec 分型命名(Ⅰ-XIII)的多重PCR 方法是针对MRSA 开发的，这使得CNS 中的许多SCC mec 无法分型或命名[10]。
本研究中50%的分离株不可分型，这可以用存在新的SCC mec 类型来解释。Szczuka 等[23]报道82%的SH 不能进行SCC mec 分型，Maleki 等[24]也曾报道75.8%的SH 不能进行SCC mec 分型。这些大量的不可分型菌株包括携带多个ccr 基因的菌株、携带ccr 基因而没有mec 复合体的菌株以及既没有ccr 基因也没有mec 复合体菌株[25]。本研究中不可分型的菌株中既没有ccr 基因也没有mec 复合物但是mecA 基因阳性，这种大量仅携带mecA 基因的菌株少有报道，但Djoudi 等[21]认为mecA 等位基因可以独立地整合到任何类型的SCC mec 元件中，其具体机制有待进一步研究。
目前，PFGE 是公共卫生监测、疾病聚集性鉴定
如梦令赏析
的菌株(除137和138两株菌外)是从本地区不同医院的病房分离出来的。另外，将78株MRSH 的耐药模式与PFGE 相结合分析，结果表明6组100%同源性菌株中，N02型别中43、76菌株间，N04型别中137、138菌株间，N08型别中61、11菌株间，N10型别中115、2菌株间带型相同及耐药模式菌相同。N01型别中116、19菌株间，N02型别中34、60、43/76菌株间，N04型别中3、137/138菌株间，N05型别中39、69菌株间带型相同，但耐药模式不同。其他型别中不同带型的菌株存在相同的耐药模式。3 讨论
近年来，SH 已成为医院感染的重要病原菌，尤其在血流感染分离株中越来越多见，主要与免疫力低下患者或由医院植入设备引起的感染有关[12]。在CNS 中，SH 对甲氧西林有较高的耐药率，据统计
MRSH 可达到90％以上[13]。众所周知，葡萄球菌对甲氧西林的耐药机制与mecA 基因的表达有关，mecA 基因编码修饰青霉素结合蛋白PBP2a 。我们的数据表明大多数(96.2%，75/78)的MRSH 含有mecA 基因，另外3株mecA 基因阴性的MRSH 的具体机制有待进一步研究，与之前报道的对甲氧西林耐药的葡萄球菌不一定都含有mecA 基因的结论一致[14-15]，这种情况可能与mecA 的同源性物质存在或青霉素酶高度表达等机制有关。体外药敏结果显示甲氧西林-红霉素-克林霉素-左氧氟沙星为本地区MRSH 最常见的多重耐药组合，这可能与临床医生长期使用此类抗菌药物相关，需要引起临床高度警惕。本研究发现1株菌对拉宁耐药(MIC>16μg/mL)，有13株菌的拉宁的药敏结果呈中介值(MIC:16μg/mL)。另外，发现2株菌对利奈唑胺低水平耐药(MIC:8μg/mL)。利奈唑胺最常见的耐药机制是23S rRNA V 区的经典突变G2576T 。我们的研究中没有发现对万古霉素耐药的SH 。近年来，不断有文献报道SH 对糖肽类抗菌药物及利奈唑胺的敏感性降低以甚至耐药[13,16]。SH 的多重耐药特征以及对糖肽类和利奈唑胺耐药的趋势已经成为我们关注的严重的健康问题。
SCC mec 是一种可移动元件，广泛分布于葡萄球菌中，尤其在CNS 中分布更为广泛。Saber 等[17]对国内外的人及动物中分离的CNS 菌株的SCC mec 表型做了一个综合分析，数据表明表皮葡萄球菌及SH 中的SCC mec 分布最广。我们研究数据结果显示，在SCC mec 可分型的MRSH 中，主要以SCC mec Ⅰ
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