▽
动物疫苗的乳化
01
动物疫苗的乳化是指将抗原液分散在油佐剂中所形成稳定的异源系统，注⼊动物体内后，能⾮特异性地增强动物机体对抗原的特异免疫应答，并延长免疫持续期。由于油佐剂能将抗原物质吸附或黏着，注⼊动物机体后可较久地存留在体内，持续地释放出抗原物质来不断刺激机体的免疫系统，从⽽能持久地提⾼抗体效价，提⾼疫苗的免疫效果。因此，⼈们不断研究动物疫苗的乳化效果和新型油佐剂，以便获得更有效、更安全和更稳定的疫苗。 ⼀
动物疫苗的乳化及佐剂
1.1动物疫苗的乳化
油佐剂疫苗是指抗原液体或微粒（滴）（分散相或内相）借助乳化剂，在机械⼒的作⽤下，分散悬浮于不相溶的油佐剂液体（连续相或外相）中所形成相对稳定的分散体系。
1.2动物疫苗乳化剂
两个不相混容的纯液体不能形成稳定的油乳剂，必须要加⼊第三组分（起稳定作⽤）—乳化剂，以降低体系的界⾯能。乳化剂属于表⾯活性剂，其主要功能是起乳化作⽤，才能形成油乳剂。例如，将注射⽤⽩油和抗原液放在试管⾥，⽆论怎样⽤⼒摇荡，静置后都会很快分离。但是，如果往试管⾥加⼀点乳化剂，再摇荡时就会形成象⽜奶⼀样的乳⽩⾊液体。乳化剂指动物疫苗中分散相与连续相两相间的界⾯活性物质，可促进和稳定两种互不相溶物形成乳剂，如弗⽒佐剂中的⽺⽑脂，油佐剂中的Span-80、Arlacel-80、Tween-80等。动物疫苗的乳化见图1。 图1 动物疫苗的乳化
⼆
动物疫苗的剂型
通常动物疫苗的乳化过程中⼀相是⽔相抗原和极性⼩的有机液体油相油佐剂，习惯上统称为“油”。根据内外相的性质，油乳剂主要有三种类型，⼀类是油分散在⽔中，简称为⽔包油型油乳剂，⽤O/W表
⽰；另⼀种是⽔分散在油中，简称为油包⽔型油乳剂，⽤W/O表⽰，还有⼀种复合油乳剂，它的分散相本⾝就是⼀种油乳剂，如将⼀个W/O的油乳剂分散到连续的⽔相中，⽽形成⼀种复合的双相W/O/W型油乳剂。不同的动物疫苗剂型的特性见表1。
表1 动物疫苗剂型的特
2.1
动物疫苗剂型检测
动物疫苗不同的剂型有不同的特点，根据不同的免疫要求、免疫动物、免疫途径和抗原类型综合选择理想的剂型。⽔包油(O/W)安全性⾼，但扩散快，佐剂活性较低；油包⽔（W/O）能在肌⾁注射部位贮存相当长⼀段时间，能给抗原提供短期及长期的免疫增强作⽤，但是刺激性⼤，安全性不⾼；W/O/W安全性，佐剂活性介于以上两者之间。
夺命连线⼀般根据不同剂型的不同特点，可以⽤下列⽅法加以简要鉴别：
⼀般根据不同剂型的不同特点，可以⽤下列⽅法加以简要鉴别：
2.1.1稀释法
乳剂易被与外相介质相同的液体稀释，⽽难溶于与内相相同的介质。稀释法，也称⼩液滴实验，就是利⽤这⼀特点，⽤⽔或油对动物疫苗做稀释试验，来鉴别动物疫苗的基本剂型，见图2。能与⽔相容的则是⽔包油(O/W)，⽽浮在⽔的表⾯（见图2B）或能溶于油的则为油包⽔（W/O）。W/O/W，在⽤稀释法检测剂型时，W/O/W同O/W⼀样，都能溶于⽔，但是前者液滴部分⾃我稀释，扩散速度相对较慢，并使⽔呈乳⽩⾊（见图2C），⽽⽔包油型乳液在滴⼊冷⽔中⽴即散开，与⽔溶于⼀体(见图2A)。
图2 动物疫苗的⼩液滴实验
2.1.2镜检法
镜检（10×100倍）能观察到不同剂型，具体见图3：其中图A、B、C分别为O/W,W/O/W,W/O型乳剂。同时利⽤显微镜还能定性观察到乳剂粒径⼤⼩，均⼀性，及双相所占⽐例⼤⼩。
图3 显微镜下的动物疫苗剂型
2.1.3电导法
⼀般油类物质的导电性差，⽽⽔类物质是⼀种良好的导电载体。因为不同剂型动物疫苗的外相或为⽔、或为油，故可利⽤电导法来测量其剂型。测量电导的仪器为电导仪。或可以设计⼀个简单的回路，两节电池，⼀个⼩灯泡，⽤导线相连，但设计成开路，将未接合导线两端插⼊溶液中，若灯泡亮，
则有O/W乳剂，反之为W/O乳剂。⽤电导仪直接测电导率也能够区别剂型，如油包⽔W/O电导率约为0，⽔保油包⽔W/O/W约为5,⽔包油O/W约为10。
2.1.4染⾊法
齐白石的人格
唯物主义认识论通常使⽤的⽔溶性染料为甲基蓝，甲基蓝亮蓝FCF等，油溶性的染料为苏丹红Ⅲ。针对O/W或W/O的外相分别为⽔或油，分别向其中投⼊⽔溶性或油溶性染料，若⽔溶性染料扩散溶解，整个乳液呈现⽔溶性燃料的颜⾊，则为O/W乳剂，反之则为W/O。
2.2
油乳剂动物疫苗的光学性质
油乳剂动物疫苗的外观⼀般常呈乳⽩⾊不透明液状，油乳剂之名即由此⽽得。油乳剂的这种外观是与分散相粒⼦之⼤⼩有密切关系。由胶体的光学性质可知，对⼀多分散体系，其分散相与分散介质的折光率⼀般不同，光照射在分散微粒（液滴）上可以发⽣折射、反射、散射等现象。当液滴直径远⼤于⼊射光的波长时，主要发⽣光的反射（也可能有折射、吸收），当液滴直径远⼩于⼊射光波长时，则光可以完全透过，这时体系呈透明状。当液滴直径稍⼩于⼊射光波长时，则有光的散射现象发⽣，体系呈半透明状。⼀般油乳剂的分散相液滴直径的⼤⼩⼤致在0.05－1.0µm的范围，可见光波长为0.40
－0.76µm，故油乳剂中的反射较显著，因⽽⼀般油乳剂是不透明的乳⽩⾊液体。这就是油乳剂的微粒⼤⼩与外观之关系。
三
动物疫苗佐剂
佐剂是协助激活先天免疫系统，让机体误认为疫苗是真的外来威胁的病原因此发动抵御功能做出免疫应答。⽬前常⽤的油佐剂是指⼀类由油类物质和乳化剂按⼀定⽐例混合⽽形成的佐剂。动物疫苗佐剂见表2。
表2 动物疫苗佐剂
3.1合成佐剂
3.1合成佐剂
⽬前最⼴泛使⽤的油为⽩油。⼀⽅⾯⽩油具有极低的渗透性，和很好的封闭性。这能使油乳佐剂在注射部位发挥贮库效应，延长抗原在体内的停留时间，使抗原具有缓释性，并能防⽌体液中酶的分解，从⽽持续刺激机体，增强抗原的免疫原性。Drakocel-6 VR、Marcol-52、Lipolul-4等均是国外常⽤的
⽩油。SEPPIC佐剂、Montanide ISA50、ISA206均是基于矿物油的佐剂，佐剂活性强。另⼀⽅⾯，⽩油在机体组织内因不能代谢⽽长期存在，造成局部组织损伤，能引起注射部位的毒副反应。⽬前国内⼤多数疫苗⼚家采⽤法国SEPPIC油佐剂，少数疫苗⽣产商圆环、⽀原体、细⼩病毒等疫苗中⽤赛德奥⽣物科技MERCKINADE 206和MERCKINADE 25。
m13引物3.2可代谢性油佐剂
另外⼀类很重要的油即为代谢性油，包括植物油和动物油，与⽩油相⽐有着能被机体代谢，局部反应⼩的优势，但⼤多数种类受到原料价格较⾼、易氧化或佐剂活性较差等限制。佐剂65是以花⽣油为油相制成的W/O型佐剂，MF59是以⾓鲨烯为油相制成的O/W型佐剂，⽽SAF则是以⾓鲨烷为油相制成的O/W型佐剂。这些乳化佐剂，佐剂效应⾼，安全性好。⽬前，MF59佐剂由于其⾼佐剂效应及低毒性，已在欧洲20多个国家被批准⽤于⼈⽤疫苗。
四
动物疫苗乳化制备
油乳剂的制备在确定其合理的配⽅后，其乳化技术也是极其重要的。疫苗乳化的制备主要是混合技术。虽然混合技术⽐较单纯，但作为疫苗，要求有多种功能和性质，要制备出性质优良和稳定的疫苗，
并不是⼀件简单的事。油乳剂是由⽔相和油相所组成的，动物疫苗乳化的制备⼀般是先分别制备出⽔相和油相，然后再将它们混合乳化。
4.1
乳化⽅法
传统的乳化⽅法需要将乳化剂加⼊的矿物油中制备油相，但⽬前⼤多数均采⽤商品油佐剂如法国SEPPIC油佐剂和赛德奥⽣物科技油佐剂，直接进⾏⼀步法乳化，⽆需添加乳化剂。
4.1.1油相的制备，将商品化的油佐剂如，116℃⾼压灭菌30min，即为油相。
4.1.2⽔相的制备，取抗原液（通常先灭活）加⼊2% Tween-80混匀即为⽔相。
4.1.3按油相与⽔相1:1(v/v)混合乳化，即将油相置组织捣碎容器内，慢速搅动油相，同时缓慢加⼊⽔相进⾏乳化，最后⾼速乳化成W/O型油乳剂抗原制剂，在乳化过程中亦可根据乳剂的粘稠度适当调节油、⽔相⽐。
4.1.4或者将粘稠的W/O型油乳佐剂抗原制剂再加⼊2% Tween-80⽣理盐⽔后继续乳化成双相抗原制剂。
4.1.5也可直接制成双相油乳佐剂抗原制剂。如SEPPIC Montanide ISA 206 VG和赛德奥⽣物科技MERCKINADE 206和MERCKINADE 25。可⼀步法乳化，与抗原液混合成剂只需要搅拌均匀即⾃⾏成剂。
4.2
乳化设备
制备油乳剂的机械设备主要是乳化机，它是⼀种使油、⽔两相混合均匀的乳化设备，⽬前乳化机的类型主要有：乳化搅拌机、胶体磨、⾼压均质机和⾼剪切乳化均质机。依据油乳佐剂和抗原制剂特性选择适当乳化设备。
4.3
影响疫苗乳化效果的因素
4.3.1乳化设备
乳化机的类型及结构、性能等与油乳剂微粒的⼤⼩（分散性）及油乳剂的质量（稳定性）有很⼤的关系。⽔包油O/W和双相⽔包油包⽔W/O/W如SEPPIC Montanide ISA 206 VG⼤多数采⽤低剪切多层搅
拌的双层乳化罐，其设备参数：乳化温度批次量、搅拌桨直径、搅拌速度、罐体⾼度、罐体直径和罐体⽐例等。⽽油包⽔W/O如SEPPIC Montanide ISA 50 V2⼀般采⽤低剪切预乳化和⾼剪切乳化，有批量流程的顶部搅拌和底部搅拌、在线流程的循环和转移等⾼压均质⼯艺设备，其中批量流程顶部搅拌和底部搅拌的⼯艺设备容易操作，重复性好⽐较稳定，但⼤规模⽣产中因消耗⾼能量⽽费⽤⾼；在线流程的循环⼯艺设备和转移⼯艺设备不易清洁灭菌，⽽且通常过程⽐批量流程长，其设备关键参数：⾼剪切定⼦-转⼦，⾼剪切搅拌⼏何、涡轮速度和搅拌周期；设备均质的能⼒如罐⼦⼏何体积，搅拌设备的速度，⽔相加⼊的速度等；预乳化的步骤等。
4.3.2温度
乳化温度对乳化好坏有很⼤的影响，但对温度并⽆严格的限制，如若油、⽔皆为液体时，就可在室温下凭借搅拌达到乳化。⼀般乳化温度取决于⼆相中所含有⾼熔点物质的熔点，还要考虑乳化剂种类及油相与⽔相的溶解度等因素。另外在乳化过程中如粘度增加很⼤，所谓太稠⽽影响搅拌，则可适当提⾼⼀些乳化温度。若使⽤的乳化剂具有⼀定的转相温度，则乳化温度也最好选在转相温度左右。乳化温度对油乳剂微粒⼤⼩有时亦有影响。实际经验证明SEPPIC MONTANIDE ISA 206 VG的乳化温度为32~35℃，⼀般将⽔相抗原和油相佐剂（灭菌）分别加热到32~35℃，搅拌时将抗原加⼊到佐剂中。对热敏感的抗原，抗原低温抗原（4~8℃）加到⾼温佐剂中（40-45℃）搅拌乳化，控制搅拌容器的温度在32~35℃，乳化结束后需要不搅拌降温到12℃。⽽油包⽔W/O剂型因在⾼速、⾼压均质⾼剪切乳
化⾼速产热避免⾼温，乳化温度应控制在25℃以下。
4.3.3乳化时间
乳化时间显然对油乳剂的质量有影响，⽽乳化时间的确定，是要根据油相⽔相的容积⽐，两相的粘度及⽣成油乳剂的粘度，乳化剂的类型及⽤量，还有乳化温度，但乳化时间的多少，是为使体系进⾏充分的乳化，是与乳化设备的效率紧密相连的，可根据经验和实验来确定乳化时间。如⽤均质器（3000转/分钟）进⾏乳化，仅需⽤3－10分钟。在双相⽔包油包⽔W/O/W低剪切乳化时乳化时间与搅拌速度和乳化体积匹配乳化，如批次量⼤搅拌速度低，乳化搅拌时间长。
4.3.4搅拌速度
浙江树人大学学报乳化设备对乳化有很⼤影响，其中之⼀是搅拌速度对乳化的影响。搅拌速度适中是为使油相与⽔相充分的混合，搅拌速度过低，显然达不到充分混合的⽬的，但搅拌速度过⾼，会将⽓泡带⼊体系，使之成为三相体系，⽽使油乳剂不稳定。因此搅拌中必须避免空⽓的进⼊，真空乳化机具有很优越的性能。双相⽔包油包⽔W/O/W佐剂如SEPPIC Montanide ISA 206和赛德奥⽣物科技MERCKINADE 206油佐剂在混合乳化时避免⾼速、⾼剪切及⾼压均质，⼀般采⽤低剪切乳化搅拌，并且不同的⽣产量乳化罐容积匹配不同的搅拌速度，搅拌速度⼀般在80rpm~500rpm之间。油包⽔W/O油佐剂⼀般采⽤100rpm低剪切预乳化后⾼剪切乳化，转速⼀般在3000rpm~14000rpm之间，不同的⼯艺、不同的批量
及抗原加⼊速度选择不同的⾼剪切转速。
五
动物疫苗的稳定性
5.1
动物疫苗的稳定
动物疫苗乳化后形成油乳剂，动物疫苗的稳定是指疫苗油乳剂状态和性质在⼀定条件下（时间、温度等）不发⽣变化或⽆显著变化。动物疫苗的稳定性是指疫苗在指定的时间内阻⽌物理、化学性质变化的能⼒。由于油乳剂系⾃⾝热⼒学不稳定性，在乳化⼯艺上尽管采取很多措施维持其动⼒学稳定性，使油乳剂能较长时间（⼏个⽉到⼀年）或在较苛刻条件（⾼温、低温等）下稳定，但在实际⼯艺中还是不够达到理想的稳定状态，所以对乳化后的乳剂进⾏乳化效果和稳定性测试。
5.2
动物疫苗稳定的原因黄汉清
油乳剂动物疫苗之所以能够稳定存在，主要是在油乳剂制备的同时加⼊了乳化剂作⽤结果，包括：①降低油乳剂内相在外向中⾼度分散后的表⾯能，主要通过乳化剂在油-⽔界⾯的吸附来实现；②在内相液滴外周围形成⾼度封闭层，主要通过油-⽔界⾯形成楔形定向膜来实现；③形成了内相液滴聚结、融合的屏障，这主要通过靠⾼的外相黏度来增⼤内相液滴
过油-⽔界⾯形成楔形定向膜来实现；③形成了内相液滴聚结、融合的屏障，这主要通过靠⾼的外相黏度来增⼤内相液滴运动阻⼒，靠外相中柔和⾼分⼦化合物的缠绕屏蔽作⽤；④内相表⾯荷电形成了厚的扩散双电层和⾼的ξ电位；⑤乳化剂分⼦在内相液滴表⾯的快速、⾼密度吸附，可使“⾦蝉脱壳”的内相液滴再次形成屏蔽壳。⼀个好的乳化剂能够快速的吸附到油-⽔界⾯上，以降低界⾯表⾯张⼒并促进新的界⾯的形成与稳定，避免分散相液滴的重新聚结。
5.3 动物疫苗不稳定的表现形式
油乳剂的稳定是相对的，不稳定是绝对。油乳剂的不稳定表现形式很多，主要有聚结、絮凝、分层、破乳和相的转变等。油乳剂的分散相⼩液珠聚集成团，形成⼤液滴，最终使油⽔两相分层析出的过程。破乳是油乳液动物疫苗内相和外相完全分离的过程。分层是由均匀乳状液分为两层乳状液的过程。乳液在不发⽣油⽔分离的情况下由O-W转变为W-O 型，或由W-O型转变为O-W型的现象被称为相转变。破乳后的油乳剂疫苗降低或失去免疫保护，⽽且会引起不良反应。在实践中搞清造成动物疫苗不稳定的因素主要是物理因素还是化学因素，对正确地选择改善动物疫苗稳定性措施很重要。
5.4
动物疫苗乳化效果及稳定性的常见评价指标
乳液需要⼀段时间稳定，因此乳化效果及稳定性检查⼀般在乳化的第⼆天进⾏。
5.3.1动物疫苗剂型检测
稀释法测试疫苗剂型，⼜称⼩液滴试验，乳液易被与外相介质相同的液体稀释，⽽难溶于与内相相同的介质。⽤吸管吸取适量的疫苗，滴⼊1-2滴乳液到盛有纯⽔的烧杯中，观察疫苗⼩液滴在纯⽔中的分散情况，来鉴别动物疫苗的剂型。液滴停留在⽔⾯上是油包⽔W/O乳液，液滴扩散到⽔中是⽔包油O/W乳液，液滴⼀部分停留在⽔⾯，⼀部分扩散到⽔中是⽔包油包⽔W/O/W乳液。
5.3.2分层率、分层速率和⽣存时间
将乳化的疫苗分装⾄玻璃瓶中密封后，分别放置在4℃、20℃和37℃下存放，逐⽇观察，观察疫苗是否有分层、沉淀和破乳等情况，计算出疫苗的分层率和⽣存时间，⽣存时间越长，形成的油乳剂越稳定。动物疫苗分层程度可⽤已分离的液层厚度占油乳剂总厚度的百分数表⽰，此即分层率。油乳剂分层的快慢即分层速率。油乳剂分层率和分层速率⼩者⽐⼤者稳定性好。
5.3.3液滴⼤⼩及分布
在光学显微镜或粒度分析仪下观察动物疫苗分散相液滴⼤⼩及分布。液滴分散度越⾼，直径越均⼀，稳定性越好。
5.3.4变流能⼒
通过⽤Brookfield DV+黏度计测定疫苗的黏度，⽤注射器活塞上置以标准重物（3.306kg），检查将10ml乳剂从注射器针头21G(0.8mm)/25mm完全排空所需要的时间，此法模拟疫苗注射时粘度⼤⼩影响带来的操作的难易程度。SEPPIC Montanide ISA产品乳剂流动能⼒见表3。
表3 SEPPIC Montanide ISA产品乳剂流动能⼒
5.3.5破乳电压
将W/O型的油乳剂放⼊两个加直流电的极板间，逐渐加⼤直流电压，当电压⼤到⼀定程度时，电流击穿油乳剂的油-⽔接⾯膜，分散相液滴“破壳⽽出”，发⽣聚合，进⽽破乳，油乳剂导电所对应的电压，即油乳剂的破乳电压。破如电压越⾼，说明W/O型的油乳剂越稳定，此法不适于O/W油乳剂。
5.3.6离⼼分离法
在离⼼⼒作⽤下油乳剂分层与否及分层轻重，是衡量动物疫苗稳定性的最简单⽽快捷的⽅法。可测定
⼀定的时间内、⼀定的转速的离⼼条件下油乳剂状态变化或发⽣⼀定程度油⽔分离所需的时间，分层需要时间越长的油乳剂稳定性越好，
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议