动脉粥样硬化模型的制备
(一)原理
巨噬细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表面存在清道夫受体(scavenger receptor),能大量地摄取修饰变性的低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL),特别是氧化LDL(oxidized LDL,OX-LDL),使细胞内大量充盈脂质,在电镜或光镜下呈泡沫状,故称泡沫细胞。经油红O染后呈红颗粒状,含大量胆固醇,且胆固醇酯约占其50%。因而通过先制备OX-LDL,再使其作用于巨噬细胞或血管平滑肌细胞,即可造成泡沫细胞模型。 (二)实验步骤
1.LDL的制备:取新鲜全血200ml,不加抗凝剂分离出血清120ml,加入NaN324mg,EDTA(100mg/L)0.6ml以防腐和防氧化。调整血清密度为1.019,4 C,30000r/min,超速离心18小时。吸出上层乳白液体(为极低密度脂蛋白,VLDL)及次层淡黄液体(为中密度脂 蛋白,梦幻之声IDL);再调整密度为1.063,4 C,40000r/min,超速离心24小时。上层黄液体即为LDL。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为同一区带。在4 C,含10mg/L EDTA的磷酸缓(PBS)冲液中透析72小时,过滤除菌,4 C,保存备用。
中年同志照片2.OX-LDL的制备:将LDL在含10 mol/l CuSO4的PBS中,37 C,氧化72小时。然后于4 C,在含100mg/L EDTA的PBS中透析,每8小时换液一次,透析24小时。
LDL 的氧化程度通过测定样品中硫代酸反应物质(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)的含量加以鉴定。取样品或丙二醛标准品0.1ml加入2.9ml复合液(CCl3COOH 0.92mol/L,C4H无石棉板
4N2O2S 0.026mol/L,HCl 0.25mol/L)中,置沸水浴30min,冷却后测定其在532nm的OD值,计算TBARS含量。再以胆固醇测定试剂盒测定LDL胆固醇含量。LDL的氧化修饰程度以每克LDL胆固醇的TBARS含量表示。 3.巨噬细胞源性泡沫细胞模型的制备:参考Leonard等的方法收集巨噬细胞。取雄性、10周龄C57BL/6J小鼠,腹腔注射无血清培养基RPMI 1640 2ml,4天后再次注射RPMI 1640 4ml收集腹膜巨噬细胞,以109/L的密度种植于培养瓶中,培养12小时,弃培养液,用PBS冲洗掉未贴壁的细胞,重复3次。加入含OX-LDL(10mg/L)的RPMI 1640培养液,37 C下培
养96小时(培养瓶中置盖玻片)。
1.VSMC源性泡沫细胞模型的制备:VSMC的培养参考本书有关章节。于培养液中加入OX-LDL 10mg/L,37 C下培养96小时。37 C下培养72小时(培养瓶中置盖玻片)。
2.泡沫细胞的鉴定
1)形态学观察:从培养瓶中取出盖玻片,以PBS冲洗3次,于4 C,10%甲醛中固定24小时,用油红O染。具体方法如下:
(1)水洗5min。
(2)在60%异丙醇中放置5min。
(3)用新过滤的油红O(储备液含0.5%油红 工人之歌O、98%异丙醇,用前以水稀释至40%,24小时后过滤)染10min。
(4)用60%异丙醇分化5min。涤纶不干胶
(5)水洗5min。
(6)用Mayer氏苏木精明矾染液(含苏木精0.1%、碘化钠0.02%、钾矾5%、水合氯醛5%、枸橼酸0.1%)染5min。
(7)水洗30min。
(8)干燥封片。光镜下观察、拍照。
2)细胞内胆固醇的测定:用0.25%胰酶消化1min,收集细胞,以1000r/min离心10min,弃上清液。细胞以PBS洗涤一次后,离心去上清液。加入异丙醇0.5ml,超声破碎细胞10秒 3次。离心,1000r/min,15min。取上清液以胆固醇测定试剂盒测定总胆固醇及游离胆固醇含量,二者之差为胆固醇酯含量。于离心沉淀物中加入0.1mol/L NaOH 0.5ml,用Lowry法测定细胞蛋白含量。细胞内胆固醇及胆固醇酯含量含量以细胞蛋白含量进行校正。
(三)注意事项
1.收取血清样品应从速,最好使用新鲜血清。
2.超速离心的上样和取样时均应细心操作,尽量减少机械扰动。
3.血清密度调节的公式为:
Vo(dm-do)
Vn= --------------
dn-dm
式中: Vn为需加入的高密度液体积(ml);
dn为需加入的高密度液的密度康涅狄格州百人误诊(g/ml);
do为密度调节前血清的密度(g/ml);
dm为需调节的密度(g/ml);
Vo为密度调节前血清的体积(ml)。