沈阳军区总医院医学实验科
2012年6月15日
第一部分 细胞模型建立的操作环境
1. 细胞培养室结构布局的设计：细胞培养室的结构布局必须合理，才能够使细胞培养工作顺利地进行，否则，则可能因为环境不符合要求而导致细胞培养经常出现问题，甚至失败。细胞培养室的选址要选择建筑物中僻静，少尘，人流走动稀少的位置。细胞培养室的结构应该包括细胞培养间、更衣间、缓冲间等。细胞培养间内仪器设备的摆放要合理，总的原则是防止污染、方便实验。部分结构布局参见GMP格局设计。 2. 细胞培养室的空气净化和消毒：细胞培养室的空气质量的优劣直接影响细胞培养的质量，有条件的单位应当安装空气净化设备，使细胞培养间的空气至少达到10万级，局部百级。如果没有条件，细胞培养间的窗户应该密闭，以防止外界的灰尘进入。细胞培养间应安装紫外线灯，在进行细胞培养前照射30分钟。每周应用过氧乙酸或福尔马林熏蒸消毒以及其他化学 消毒剂消毒和熏蒸(消毒和熏蒸方法见附件10)。
3. 超净工作台和生物安全柜：超净工作台和生物安全柜是细胞培养必须的设备，在超净工作台和生物安全柜中，可以保持空气的质量达到百级，在这样的局部环境中进行细胞培养操作，可以避免因为空气所导致的污染。在使用前必须对超净工作台和生物安全柜进行一系列预处理，（1）紫外线照射30分钟；（2）打开风机，运行10～15分钟；（3）用75%医用酒精擦拭工作台面和内面四壁。（4）退场时也要用75%医用酒精擦拭工作台面和内面四壁后撤场。详细操作按《BSC-1500ⅡA2-X型生物安全柜操作规程》执行。
4. 细胞培养室内温度和湿度的控制：细胞培养室内温度和湿
度不合适，容易导致细菌霉菌生长，极易引起细胞污染，
因此，必须对细胞培养室内温度和湿度进行控制。对温度
的控制一般使用空调，将室内温度控制在20-25℃之间。
湿度过大容易导致霉菌生长，温度及相对湿度标准：温度
异常睡眠
18～26℃，相对湿度45～65%。详细内容见《洁净区压差
及温湿度监控规程》。
5．细胞培养室的定期清洁消毒：细胞培养室的清洁消毒分为日清洁消毒、周清洁消毒和月清洁消毒。日清洁：每日工作完毕后，及时清扫细胞培养间，将实验用过的耗材、废液等移出细胞培养间， 以75%医用酒精擦拭工作台面和各种仪器表面。周清洁：每周安排固定的时间对细胞培养间进行清扫，包括以75%医用酒精擦拭工作台面和各种仪器表面，以过氧乙酸或爱尔施消毒液擦拭地板，紫外灯空气消毒或过氧乙酸熏蒸空气消毒。月清洁：对细胞培养间进行一次彻底地大清扫，包括以75%医用酒精擦拭超净工作台和生物安全柜，以过氧乙酸或爱尔施消毒液擦拭工作台面和四壁、地板，以75%医用酒精擦拭各种仪器表面。将CO2培养箱底部的水抽干，用75%医用酒精擦拭CO2培养箱内壁和搁板，更换无菌的蒸馏水。详细操作见《洁净区卫生清洁消毒规程》。
6. 细胞培养室的各种仪器设备：包括CO2培养箱、超净工作台和生物安全柜、低温离心机、倒置显微镜，冰箱等。在使用前要对各种仪器的操作、清洁、保养制定规程，并反复地学习掌握这些规程，才能熟练地操作使用这些仪器设备。细胞培养室的各种仪器设备的
摆放要合理，有利于防止污染，方便实验。如超净工作台或生物安全柜要摆放在细胞培养室远离门的地方，以免人员进出产生的空气流动会对超净工作台或生物安全柜内开放的细胞培养造成污染。CO2钢瓶的压力表要定期记录，一旦气体压力不足，要及时更换。要经常观察和记录CO2培养箱显示屏中的温度、网络风云C02浓度值，发现异常及时报告及修理。超净工作台或生物安全柜使用一定时期后，根据产品说明书的要求，要及时更换空气滤芯。参照《设备操作保养及清洁规程》中相应设备的操作、保养和清洁规程进行。
7. 进出细胞培养室的要求：细胞培养室对进出的人员要进行严格的规范。在进入细胞培养室之前，要洗手，带上一次性口罩和帽子。进入更衣室内，换拖鞋，更换专门的无菌衣，才能进入细胞培养室。操作结束后，离开细胞培养室时，要对细胞培养室进行清扫，将细胞培养间的物品摆放整齐，以75%医用酒精擦拭工作台面和各种仪器表面，将实验用过的耗材、废液等物品带出细胞培养间。
第二部分 细胞模型建立的试剂和耗材准备
一、 材料和试剂的准备
三乙醇胺乳膏根据实验要求，培养细胞种类对细胞模型建立进行材料和和试剂准备，主要参见《贴壁细胞冻存复苏、传代操作规程》和《悬浮细胞冻存复苏、传代操作规程》
二、细胞培养材料的清洗与灭菌
清洗与消毒是细胞（或组织）培养实验的第一步，是细胞（组织）培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞生长好坏与清洗有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留痕量，也能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也受到影响。
(一)清洗
1.新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸中，以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2.使用过的玻璃器皿的清洗
暴强回复(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗内外7遍，倒置自然干燥。
(3)浸入清洁液（清洁液配制见附件）过夜。
(4)从清洁液捞出后自来水冲洗10～15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或吸管、平皿消毒不锈钢桶)，外套包布，标明消毒日期。
(6)高压(15磅20 min)或干热(160～180℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用，有效期15天。
3.胶塞的处理
（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2％NaOH煮沸10-20 min未成年的主张。
（2）自来水清洗10次。
（3）再用1％稀盐酸浸泡30 min。
（4）自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌(见消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，蒸馏水洗涤3次，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
（二）灭菌
本节能独立掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
>数学模型的作用
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