25卷2期Vol.25.No.2
草业科学
PRAT ACULTURAL SCI ENCE
97夺标800
PM16研究进展
王康，朱慧森，董宽虎
(山西农业大学动物科技学院，太谷山西030801)
摘要：通常在逆境胁迫下植物细胞会积累一系列的蛋白质来保护细胞免受伤害，其中LEA蛋白是目前研究最为普遍的一种。综述了与抗旱性密切相关的LEA蛋白的结构、性质、分类与功能，并对一经在Genbank 中登录的LEA基因家族成员进行了汇集整理。以大豆Glycine ma x LEA蛋白基因家族成员之一的P M16为代表，对其基因以及所编码的LEA蛋白进行了生物信息学分析。
关键词：抗旱性;LEA蛋白;LEA基因;PM16
中图分类号:Q943文献标识码:A文章编号:100120629(2008)022*******
在农业生产中，经常会遇到各种不良的环境条件，如干旱、洪涝、低温、高温、盐渍化以及病虫害等，世界上每年都有不同程度的自然灾害发生。陆生植物最常遭受的环境胁迫就是缺水，植物在复杂多变的环境生长过程中，突发性和短暂性干旱经常发生，从而影响着植物的正常生长发育，同时当植物受到冷害和盐胁迫时也会产生由于细胞水分亏缺引起的生理干旱。我国西北、华北地区干旱缺水是影响农林生产的重要因素，南方各省虽然雨量充沛，但由于各月分布不均匀，也时常有干旱危害。因此植物的耐旱性分子机理研究及其应用成为当前研究的一个热点。迄今为止，国内外科研工作者已经形成一种共识[1]，就是通过筛选与植物的抗旱性相关的基因，认识其功能，揭示抗旱相关因子的信号转导途径，在此基础上，通过生物技术手段进行转基因育种等，从而获得耐旱能力强的新品种。
通常在逆境胁迫下，植物体内有些正常蛋白质的合成被抑制，但同时也会诱导出许多新蛋白质的合成，即在逆境中出现一些起保护细胞作用的逆境蛋白[2,3]，如热休克蛋白(heat shock pro2 teins,H SPs)、低温诱导蛋白(low2temperatur e2 induced protein)、病原相关蛋白(pathogenesis2 related proteins,PRs)等。胚胎发育晚期丰富(late embr yogenesis abundant,LEA)蛋白就是其中之一，它是种子发育后期产生的一类小分子特异多肽，伴随着种子成熟过程而产生的，通常在胚胎发育晚期的特定阶段表达，当种子萌发时很快消失。然而在植物受到干旱胁迫时,LEA蛋白则
*收稿日期:2007201216
基金项目：山西省青年科学基金资助(2006021036)
作者简介：王康(19822)，男，山西霍州人，在读硕士生，专
业方向草地资源与草地管理。
E2mail:wan gkan gkan g224@yahoo 通讯作者：董宽虎E2mail:dongkuanhu@sxau.edu
Research pr ogress on pr oline and its biosynthesis enzymes in plant
ZH AO Rui2xue,ZH U H ui2sen,CH EN G Yu2hong,DON G Kuan2hu
(College of Animal Science and Technology,Shanxi Agricultural U niversity,T aigu030801,China) Abstr act:T he free proline plays an important role for osmotic adjustment and plant protection.The resear ch wor k on the natural distribution,synthesis and accumulation of fr ee proline were reviewed in this paper.T he genes,which are related to proline,registered in GeneBank were listed as well.
Key words:drought tolerance;salinity tolerance;proline;P5CS;P5CR;D2OAT;ProT
会大量积累，表明该蛋白具有干旱保护功能[4]。
下面就LEA蛋白及其基因以及PM16目前研究的概况做一简要综述。
1LEA蛋白的结构特点与功能
1981年Dure等在胚胎发育后期的棉花Gos2 sypium sp.子叶中分离到了一组丰富表达的mR2 NA，命名为LEA mRNA，其翻译产物即为LEA 蛋白。它广泛存在于高等植物的种子中，能够在水分亏缺时保护膜系统及其它生物大分子免受破坏[5]。但与储藏蛋白不同,LEA蛋白不限制在生长的种子中，在水分亏缺、盐胁迫、渗透胁迫和冷害条件下的植物组织中都积累该蛋白。
LEA蛋白相对分子质量较小,10~30kD。它是一类亲水性大家族，共同特点是由极性氨基酸组成，为亲水性的多肽，富含甘氨酸、赖氨酸等亲水氨基酸，疏水氨基酸含量很少，具有很高的亲水性和热稳定性，即使在煮沸条件下也能保持水溶状态[5]。
dna探针
关于LEA蛋白的分类，其标准最早来源于被分类的蛋白与棉花LEA蛋白氨基酸序列同源性的比较[9]。已知的棉花中LEA蛋白有6种:LEA2D19、LEA2D11、LEA2D7、LEA2D113、LEA2 D29和LEA2D95。前3种与其它植物中的LEA 蛋白存在氨基酸序列上的同源区，因此划分为3个主要的组，即gr oup1LEA蛋白[13]、group2LEA 蛋白[17]、gr oup3LEA蛋白。随着研究的不断深入，新的组不断被发现，如今
依照LEA蛋白的氨基酸序列和mRNA同源性划分，一般分为6族[10]:LEA2D19(1族)、LEA2D11(2族，又称脱水素)[6]、LEA2D7(3族)[14]、LEA2D113(4族)[8]、LEA2D29(5族)和LEA2D95(6族)，后两族为附加族，见表1[18]。
2LEA蛋白分子生物学研究进展
植物受旱能诱导一些基因表达，从而对细胞结构起保护作用,LEA基因是其中之一。该基因通常组成小的复合基因家族，它们的基因中包含有重复的序列区，同一家族的不同基因间在序列的重复次数上会有所差异，并且不同基因的表达也非密切相关。表2列举了LEA基因家族中一些在GenBank中登录的成员及其所编码的LEA 蛋白[11,12,16]。
LEA基因含有真核生物基因的特征，启动子
表1不同族LEA蛋白的结构特点及相关功能
结构特点代表蛋白功能
1族具有多拷贝串联的20个氨基酸残基组
成的保守序列，有较强的亲水性和无序
结构，能吸附大量束缚水。
棉花LEA2D19;
小麦Em蛋白;
大麦B19蛋白等。
对胚乳发育和植物生长器官的渗透
胁迫有保护作用。
2族在C端具有富含赖氨酸的15个氨基酸
保守序列，即EKKGI MDKIKEKLPG,
也称K片段，另外还存在Y片段和S片
段，共同拼接形成脱水素。
棉花LEA2D11;
水稻rab21蛋白等。
在生物代谢中有分子伴侣和亲水性
溶质的作用，从而保护蛋白结构及功
能，与植物抗旱性密切相关。
3族含有11个氨基酸重复序列:T AQ AA KEK2
A GE，形成两亲性(amphypaphic)A螺旋。
棉花LEA2D7;
油菜LEA76蛋白等。
在细胞脱水过程中有滞留富集离子
的作用。
4族该族蛋白缺乏重复序列单元，但在N端
保守，形成兼性A螺旋,C端序列保守性
较差。
棉花LEA2D113,LEA214;
Craterostigma PGC27245等。
在膜结构中可能形成一种保护结构、
或起束缚离子的作用，在植物脱水时
可保持膜稳定性，以代替水的作用。
5族含有重复的氨基酸序列，但每个残基位
置缺乏高度专一性。
棉花LEA2D29,LEA2D34;
拟南芥At ECP31;
胡萝卜DCECP31等。
在植物缺水期间与离子起螯合作用,
有富集离子的作用。其积累与耐盐
胁迫有关。
6族只有在高水平表达并与其它LEA蛋白
或渗透调节相关联时才能发挥其功能。
棉花LEA2D95;
大豆LEA2D295等。
防止脱水伤害。
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表2一些植物中LEA基因及其编码的LEA蛋白(截至2006年8月)基因登录号来源碱基长度(bp)类型表达产物
pGmPM8Z22872G.max1748mRNA LEA3 pGmPM10U02966G.max1794mRNA LEA3
pM A2005X56882T r iticum aestivum(bread wheat)934mRNA LEA3 ATECP63D64140Ar abidop sis tha liana(t hale cress)1572mRNA LEA3 ATECP63CS288203 A.thali ana(thale cress)1572DNA LEA protein
pH VA1X13498H or deum vulga r e sp.997mRNA ABA2inducible pH VA1 protein(AA12213)
PM30AF117884G.max711mRNA LEA3
ZLDE-2AY351918G.max749mRNA LEA protein
PM16DQ263624G.max936DNA LEA4
PM16AF004810G.max666mRNA LEA4
PMLG3D26552/Z29512Zea ma ys1094mRNA LEA3
H VLEAB191X62804H.vulga r e sp.692mRNA LEA B19.1
H VLEAB193X62805H.vulga r e sp.842mRNA LEA B19.3
H VLEAB194X62806H.vulga r e sp.840mRNA LEA B19.4
AtECP31D64139 A.thali ana(thale cress)1080mRNA LEA5
LEA1AY950638S isymbrium ir io567DNA LEA1
LEA3DQ196430P ha seolus vulga r is2711DNA LEA3
LEA4DQ296043Ar achis hy poga ea496mRNA LEA4
LEA4DQ073568Cr ater ostigma pla nta gineum2267DNA LEA4
LEA4DQ073567 C.p la nta gineum498mRNA LEA4
LEA2DQ097719 A.hypog aea674mRNA LEA2
LOC547493AF004805G.max798mRNA LEA1
PM29DQ263667G.max691DNA seed matur ation protein PM29AF117725G.max612mRNA seed matur ation protein PM28AF117724G.max500mRNA seed matur ation protein
课堂教学的有效性
区域有TAT A Box和CAAT Box,Poly(A)端含1个或多个内含子。有关LEA基因的定位工作也有不少报道[5]，如拟南芥Ar abid op sis tha liana 的ECP63基因定位在4号染体；拟南芥1个LEA基因定位于1号染体，并测定了具体的位置等。
LEA基因除了在种子、胚胎(包括体细胞胚胎)成熟与干燥过程中表达之外，植物的营养组织器官在受到脱水胁迫时也会诱导LEA基因的表达，一般认为植物LEA基因的表达受胚胎发育阶段、ABA[7]、脱水信号、光照等的调控[15]。
3PM16分子生物学研究进展
PM16是LEA基因家族的成员之一，目前对PM16的研究主要集中在豆科植物，在GenBank 中有关PM16核苷所登录的物种主要有:G lycine tomentella,G.tabacina,G.soj a,G.max,G.latif olia, G.canescens。
以大豆G.max为代表，其PM16基因(Gen2 Bank登录号:DQ263624)含有936个碱基对，该基因转录区由5.端非翻译区(5.untr anslated re2 gion5.UT R)、2个外显子(exon)、1个内含子(in2 tron)及3.端非编码区(3.untranslated r egion3. U TR)构成，内含子大小为498个碱基对(位于第109bp和608bp之间)。作者利用DNAStar分析软件对该序列进行了统计分析，发现这段序列的碱基组成中,(A+T)%很高，达到63.15%。而(G+C)%仅占36.85%。
该基因所编码的LEA蛋白(GenBank登录号:ABB72365)，含有133个氨基酸残基，其序列如下:
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MQSSKEKMKN MA SAAKEQVD IYKAKIDEKA EKA TARTEEE RVIAH EH AKA KEAGAKMELH EA KA RH AAEK LSANQSH YGL H H GH NNPPLV GT TQT H YQQG H QH QPLGAVP MPGT TYPSYP LGGNPNPPRN KH I
为了进一步了解该PM16所编码蛋白的结构特点，借助Prot Param tool 对该蛋白的一级结构进行了分析，发现在它的氨基酸组成中赖氨酸(10.5%)、谷氨酸(9.0%)、组氨酸(9.0%)等极性氨基酸含量非常高，而氨酸、半胱氨酸、苯丙氨
酸等非极性氨基酸则不存在，这种氨基酸残基的组成特点符合LEA 蛋白的结构特征。另外，通过REP(Searches a protein sequence for repeats 2V
新能源主题公园1.1)预测，该蛋白不含有重复的氨基酸序列，这与LEA4蛋白的结构特点相似。
SOPMA 预测大豆PM16基因所编码的LEA 蛋白的二级结构见图1，结果显示该蛋白质在N 端含有A 螺
旋，涉及73个氨基酸，占总数的54.89%,C 端则保守性差，形成无规则卷曲，涉及51个氨基酸，占总数的38.35%，与LEA4蛋白的结构特点十分吻合。10
20
30
40
50
60
70
|||||||
M QS SKEKM KN MA SAAKE QVD IYKAK ID EKAEK A T A RTEEERVIA HEHA KAKEA GAK MEL HEAK ARHAAE K hhh hh hh hhh hh hhh hh hhh hh hhh hh hhh hh hhh hh hhh hh hhh hh hh hhh hh hhh hh hhh hh hhh hh h LSANQSHYGLHHGHNNPPLVGTTQTHYQQGHQH QPLGA VPM PGTTYP
SYPLGGNPNPPRNKH I h h h t c c c e e e e c c c c c c c e e e c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c e Sequence length :
133
图1 大豆PM16基因所编码的LEA 蛋白的二级结构分析
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4展望
通过生物技术手段进行抗旱育种具有非常重要的科研价值和社会效益。在西部开发和中部崛起的大形势下，培育适合在中西部干旱缺水地区种植的作物或饲草具有深远的意义。以山西雁门关生态畜牧经济区的开发为例，可见一斑。
该地区为黄土广泛覆盖的山地型高原，地貌类型复杂多样，以山地丘陵为主，土地资源丰富，水资源短缺，气候寒冷干燥。在开展大面积种草养畜过程中，由于水资源相对缺乏，立地条件较差，其主要的饲草品种紫花苜蓿Med ica go sativa 出苗率很低，虽然在苗期选用适当的杀菌剂拌种可显著提高苜蓿出苗率[19]，但仍然会经常出现缺苗、断垄现象。国家投资的很多项目工程，如津京风沙源治理项目、退耕还林项目等完成质量不尽人意。那么，获得抗旱性高的苜蓿新品种成为目前各个工程效益高低的一个瓶颈问题。
在紫花苜蓿的抗旱性鉴定中，其重点就在于抗旱性指标的选择，归纳起来主要有形态指标、生理生化
指标、生长发育指标、生产性能指标、直接指标、间接指标等六大类。也可先利用限制性片段长度多态性(RFLP)鉴定抗旱基因的存在，并进行抗旱基因定位。单个指标在反映苜蓿的抗旱性上有一定的局限性，只有把定量与定性观测结合起来，才较为准确而可靠。目前多以田间指标或者结合若干生理生化指标对紫花苜蓿的抗旱性做出评价[20]。由于苜蓿的抗旱性受多因素的影响，鉴定其抗旱性不仅需要适当的指标，更需要在此基础上建立科学的数量化体系。
在干旱环境下，多数植物能诱导LEA蛋白的产生，虽然LEA蛋白的抗旱机制还不清楚，但大量试验已能够证实LEA蛋白抗旱功能的真实性。例如脱水还可造成第3组LEA mRNA转录水平的增加[21]。Xu等将H AV1cDNA全序列导入水稻Or yza sativa，获得了抗旱、抗盐的转基因水稻，将其导入小麦T riticum a estivum，转基因小麦的生物量及水分利用效率增加，转入燕麦Avena sa tiva，转基因植物也表现为耐旱性提高[22]。这些试验已初步证实了LEA基因可能具有干旱保护功能。
虽然国内外已经开展了不少通过生物技术手段进行的牧草抗旱育种工作，但我国应用于生产的基因工程新品种还很少，苜蓿新品种主要是通过引进。作为与植物抗旱性相关的重要蛋白因子,LEA蛋白的研究已经获得许多有价值的成果。选择LEA蛋白家族中成员PM16进行相关研究，有望在苜蓿分子育种上获得成功。PM16在许多豆科植物中已经开展了不少的基础研究, Ming等[23]曾指出，大豆中GmPM16蛋白在干旱情况下可以与糖类形成一种紧密的晶体结构，从而改变该蛋白的结构，起到保护细胞的功能等。可以利用PM16为主要的候选基因，来研究苜蓿LEA基因家族的基因结构、表达产物、信号转导
规律等等，为培育抗旱、高产苜蓿品种提供有效的基因资源和科学依据。
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