Hedgehog信号通路与慢性肝损伤后肝再生的调控 目的 初步探讨小肝细胞样祖细胞增殖过程中Hedgehog信号通路的表达及其变化。方法 按Gordon’s方案，Fisher344大鼠腹腔注射倒千里光碱后，择期行部分肝切除术诱导小肝细胞样祖细胞的增殖，反转录聚合酶链反应、实时荧光定量PCR及免疫组化等方法检测原代再生细胞均浆中Hedgehog信号通路相关成分在不同时间点的表达，并以同期正常大鼠原代肝细胞作对照。结果 小肝细胞样祖细胞增殖过程中Hedgehog信号通路多种成分表达，其中IHH、PTCH、Smo、Gli1、Gli2、Gli3 mRNA持续表达并呈动态变化，SHH表达阴性。信号分子IHH，以及反映通路活动状态的3个标志（PTCH，Gli1，Gli3）在同一时间点与对照组之间差异有统计学意义，在实验组内不同时间点之间差异也有统计学意义（均P＜0.001），时间与处理组之间有交互效应。免疫组化证实PTCH、Gli1在蛋白水平的表达。结论 Hedgehog信号通路在小肝细胞样祖细胞增殖过程中持续激活，可能是调控慢性肝损伤后肝再生的一条新的重要的信号通路。 标签：Hedgehog信号通路；小肝细胞样祖细胞；肝再生；大鼠
哺乳动物肝脏存在两类具有干细胞潜能的细胞亚，卵圆细胞和小肝细胞样祖细胞（small h
epatocyte-like progenitor cells，SHPCs），在特殊病理条件下，可以通过分化与增殖，实现肝再生[1-2]。早期的研究证实，SHPCs再生呈一种弥漫分布，持续增殖的过程。但迄今关于这类细胞的起源、特点及调控机制等仍不完全明了[3-4]。有实验分析原代SHPCs基因表达序列，发现
有Hedgehog信号通路（hedgehog signaling pathway HH）成分IHH、PTCH的表达[5-6]。HH由于存在天然植物阻断剂，且已有研究证实HH通路阻断可有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，促进凋亡，如皮肤基底细胞癌、胰腺癌等[5-7]，因此，研究HH阻断对慢性肝损伤后肝再生的影响，开发具有HH阻断效应的中药同类物或类似物，对未来中医药肝病具有一定的现实意义。因此，本课题持续检测了不同时间点HH多种成分（IHH、SHH、PTCH、Smo、Gli1、Gli2、Gli3）的表达，并从基因及蛋白水平分析信号分子IHH和反映HH活动状态的3个指标（PTCH、Gli1、Gli3）的表达及变化，初步探讨HH在肝损伤及肝再生过程中的作用，以期为进一步开发中药提供实验数据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
雄性SPF级Fisher344大鼠56只，鼠龄5周，体质量（70±10）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（粤）2003-0002，在南方医院动物实验中心SPF级饲养室进行喂养与实验。动物饲养条件：温度22～25 ℃，湿度（50±5）%，标准的12 h光照/12 h黑暗节律，标准饲料喂养，自由饮水。所有实验操作遵循南方医科大学实验动物操作条例。
什么是全球化
适应性喂养1周后，将实验大鼠随机分为实验组，即倒千里光碱联合部分肝切除组35只，正常对照组21只。
1.2 药物与试剂
倒千里光碱、collagenase Ⅳ购自美国Sigma公司，Williams’E medium购自美国Gibco公司，EDTA溶液购自D-Hanks公司；Trizol购自美国Invirtogen公司，反转录反应体系购自加拿大Fermentas公司，聚合酶链反应（PCR）体系购自美国PABI公司，实时荧光定量PCR预混合反应液购自美国ABI公司；IHH羊多克隆抗体、PTCH兔多克隆抗体、Gli1羊多克隆抗体，以及HRP标记的兔抗羊和羊抗兔多克隆二抗均购自美国Santa Cruz公司。
1.3 肝再生实验
按照Gordon’s方案[3-4]，实验组大鼠于鼠龄第6周末腹腔注射倒千里光碱（30 mg/kg）1次，第8周重复给药1次，同期正常对照组以等体积生理盐水代替。第2次给药后5周（第13周），实验组行经典的Higgins-Anderson 2/3部分肝切除术，正常对照组予模拟手术，以校正可能由手术刺激、麻醉药物的使用等引起的变化[2]。实验过程中未出现给药和手术引起的大鼠死亡。
2组大鼠分别在肝切除术后第2、3、4、7、14、21、30日麻醉后处死，每次分别处死3～5只。结扎切除尾状叶后原位分离肝脏用于原代肝细胞的制备；切取0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小的尾状叶组织3～5块放入10%多聚甲醛固定，24 h后石蜡包埋用于免疫组化分析。
1.4 原代肝细胞小肝细胞样祖细胞的分离与制备
肝组织分离及原代肝细胞制备参照文献[8-9]方法，结扎切除尾状叶后，原位分离肝脏，以350 mL温EDTA溶液（37 ℃）经腹主动脉以35 mL/min流速灌注，灌注液通过离断的腔静脉自然排出。继以38 ℃ Ca2+-enriched HBSS溶解的0.05% collagenase Ⅳ溶液以同样速率灌注10 min，当肝被膜与实质分离后，以4 ℃ Williams’E medium 150 mL按150 mL/min 流速灌注1 min后，将肝脏组织置入无菌研钵，切碎被膜，以150 ?m、厚孔径80 ?m不锈钢
滤网过滤肝实质成分，所得细胞以4 ℃ Williams’E medium 冲洗后，通过梯度离心，得到富集SHPCs的细胞成分。离心条件：低温离心50 g×1 min×3次，得到富集的原代肝细胞；实验组弃掉片状沉淀，继续以150 g×5 min×3次离心上清成分，得到富集原代SHPCs的产物[8]。所得原代细胞加入细胞保存液用于PCR、实时荧光定量PCR、Western-blot测定，或置入-80 ℃低温冰箱保存备用。1.5 反转录聚合酶链反应
反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同时间点原代细胞提取物中多种分子标志的表达。引物序列见表1、表2。测定使用ABI RT-PCR反应系统（ABI7000，美国），操作按设备标准操作程序及相关试剂盒的说明进行。Trizol提取总RNA，3 ?g的总RNA加入到20 ?L反转录反应体系中反转录生成cDNA，然后取5 ?L的cDNA加入到20 ?L的PCR反应体系中进行扩增。反应条件：93 ℃王灵台、5 min；94 ℃、30 s，54 ℃、45 s，72 ℃、60 s，35个循环；72 ℃、10 min。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳。剩余的cDNA置于-20 ℃保留备用。
1.6 实时荧光定量聚合酶链反应
采用半定量荧光探针法实时荧光定量PCR分析不同时间点IHH、PTCH、Gli1、Gli3的表达。
实时荧光定量PCR引物与荧光探针序列见表3。实验采用PE 7000全自动荧光定量PCR仪（美国Perkin Elmer公司）并按照标准操作程序进行测定。反转录合成cDNA的步骤同RT-PCR，定量分析以5 mL cDNA及引物和探针加入PCR预混合反应液中进行反应，反应条件为：93 ℃、3 min；93 ℃、45 s，55 ℃、1 min，共40循环。反应结束后，电脑自动分析计算结果。以GAPDH为内参，每个样本重复测量3次，结果以2-△△CT值表示基因表达的相对值，最终结果以3个样本测定结果的平均值作为相应时间点的测定值。
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1.7 信号分子IHH和通路激活标志PTCH、Gli1的表达测定
常规免疫组化及Western-blot检测肝组织切片信号分子IHH和通路激活标志PTCH、Gli1的表达，方法参照文献[6，10-12]方法。免疫组化所用IHH羊多克隆抗体、PTCH兔多克隆抗体、Gli1羊多克隆抗体均按1∶50稀释，HRP标记的兔抗羊和羊抗兔多克隆二抗1∶1 000稀释后进行反应，阴性对照加入0.01 mol/L的PBS。
1.8 统计学方法
采用2组重复测量的方差分析，对IHH，PTCH，Gli1、Gli3在2组间不同时间点的表达进行
比较。利用SPSS13.0统计软件进行数据处理与统计分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原代小肝细胞样祖细胞提取物Hedgehog信号通路表达及其他分子标志
RT-PCR分析SHPCs增殖早、中、晚期（术后第4、14、30日）的原代SHPCs的基因表达特征，结果显示：①SHPCs增殖过程中，IHH、PTCH mRNA持续表达，而SHH阴性；②原代SHPCs提取物中尚有其他多种分子标志的表达[13-14]，如卵圆细胞标志OV6、肝管系统标志细胞角蛋白19（CK19）、肝细胞标志CK18、肝星状细胞标志α-SMA，以及肝细胞生长因子/c-Met通路成分HNF3b、HNF4α等，提示提取物存在一定的异质性。
持续检测SHPCs增殖过程中（术后第2、3、4、7、14、21、30日）HH各相关成分，发现有IHH、PTCH、Gli1、Gli2、Gli3 mRNA的持续表达，Smo呈低表达，同样没有发现SHH表达。
2.2 小肝细胞样祖细胞增殖过程中Hedgehog信号通路激活情况
为进一步明确HH在肝再生过程中的激活情况，采用半定量实时荧光定量PCR的方法检测了HH的信号分子IHH，通路激活标志PTCH、Gli1和通路沉寂标志Gli3在不同时间点的表达。结果显示，SHPCs增殖过程中，4个指标在同一时间点与正常对照组之间（除了IHH在第21、30日，PTCH、Gli3在第2日），以及实验组内不同时间点之间，均存在统计学差异（P均<0.001）；且在时间与处理组之间存在交互效应（见表4～表7、图1）。senp
图1 实时荧光定量PCR检测SHPCs增殖过程中
IHH、PTCH、Gli1和Gli3的表达
2.3 肝再生时Hedgehog信号通路蛋白水平的表达
免疫组化和Western-blot方法检测了信号分子IHH和通路激活标志PTCH和Gli1的表达情况，结果显示：①SHPCs增殖过程中，PTCH呈持续高表达，在术后第30日的肝组织切片中仍可看到大量棕黄胞膜、胞浆染的细胞弥漫存在于肝实质中，但IHH表达阴性；②Gli1呈弱的非特异性胞浆或胞核染，难以明确证实其表达；郑州大学文学院③Western-blot未能发现3者的阳性条带。
3 讨论
SHPCs增殖呈一种慢性持续的过程，与临床慢性肝损伤有很大的相似性[1，3-4]。早期研究发现这类细胞是一组非卵圆细胞、非胆管细胞，可能为成熟肝细胞来源的干细胞亚[1，15-16]。但迄今为止，关于SHPCs，在以下几个方面仍未得到完全的阐明：①组织学起源及解剖学定位，即肝内组织、细胞来源的“niche”；②特征性的细胞生物学标志，尤其是特异的分子标志或基因/蛋白表达图谱；建议全民开展死亡教育③参与调控SHPCs增殖的机制及信号通路。
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