一、目的要求
通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。
二、实验原理
超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。 邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。
三、器材及试剂
（一）器材
恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。10ml比管、秒表、比皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。
（二）试剂
氟醇邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。
（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
（2）0.2mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制）
四、操作步骤
（一）样品的测定
（1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.
2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入25℃水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。每管做三个重复，取平均值。.
（2）同上述过程，只是用1mL的蒸馏水代替样品液，测定结果为原始管（A 原）。每管做三个重复，取平均值。
结果计算：
02﹣∙清除率（%）
× 100%
注意：
A样参比：缓冲溶液4ml+1ml样液+1ml HCl（0.05mol/L）代替邻苯三酚溶液A原参比：缓冲溶液4ml+1ml水代替样+1ml HCl（0.05mol/L）
甲基丙烯酸
（二）阳性对照试验
将抗坏血酸等抗氧化药品配制成梯度浓度，与提取样品一起进行抗氧化实验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力。方法同样品的测定，只是将样品用抗氧剂代替即可。
实验二羟自由基清除能力的测定
——抗氧化实验之二
方法一：羟自由基（·OH）清除能力的测定——邻二氮菲-Fe2+氧化法
一、目的要求
熟悉羟自由基清除能力测定的原理，掌握操作方法。
二、实验原理
羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，可以发生电子转移、夺取氢原子和羟基化等反应，可以使糖丁二醇
2012山东文综类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类都发生氧化，并损伤膜结构及功能，在研究自由基时，反应可通过水的辐射、光解及化学反应来产生羟自由基，Fenton反应是最常见的化学反应，Fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法。
邻二氮菲-Fe2+是一种氧化还原指示剂，其呈变化可反映出溶液中氧化还原状态的改变。H2O2/Fe2+体系，通过Fenton反应所产生的羟自由基（HO·），邻二氮菲-Fe2+水溶液可被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+，从而使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，根据吸光度的变化，可推知系统中HO·的产量。
Fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法，其反应机理如下：
Fe2+ +H2O2→Fe3+ +OH–+•OH
羟自由基可以与抗氧化剂发生作用，由于邻二氮菲–Fe2+水溶液显橙红根据邻二氮菲–Fe2+颜的变化可利用分光光度法（536nm处特征吸收峰的变化）对抗氧化剂的抗自由基性能进行分析。
三、器材与试剂
（一）器材
恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。试管、秒表、比皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。
（二）试剂
邻二氮菲、H2O2、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、抗坏血酸、BHT、乙醇等。
（1）0.75mmol/L邻二氮菲溶液：取邻二氮菲（邻菲啰啉）1.487g，溶于100.00ml 无水乙醇中，使用时用重蒸水稀释100倍。
（2）0.2mol/L 的磷酸盐缓冲溶液（PBS液，pH7.4）：0.2mol/LNa2HPO4 81m l ＋0.2mol/LNaH2PO4 19ml
NaH2PO4·2，分子质量156.03，0.2 mol /L溶液含31.21g/L 。
Na2HPO4·12，分子质量358.22，0. 2 mol /L溶液含71.64g/L。
（3）0.75mmol/L硫酸亚铁溶液。
（4）0.01%H2O2溶液。
四、操作步骤
（一）样品测定
将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，然后每一浓度均进行以下实验。
（1）取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液1mL于试管中，依次加入PBS液2mL 和蒸馏水1mL，充分混匀后，加0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液1mL，混匀，加0.01%H2O21mL，于37℃下温育60min，于536nm处测得其吸光度，其值为A 损伤。其空白参比2mL PBS液+4mL水。
（2）同（1），只有其中用1ml蒸馏水代替1ml H2O2，测得的吸光度称A未损伤。其空白参比为2mL PBS液+4mL水。
（3）用提取物试样液1ml代替（1）中的1ml蒸馏水，测得的吸光度称A样。其空白参比为1mL 试样液+2mL PBS液+3mL水。
（二）阳性对照试验
将抗坏血酸等抗氧化药品配制成梯度浓度，与提取样品一起进行抗氧化实验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力。方法同样品的测定。
（三）注意事项
测定时加样方法对结果有重要影响，须先将邻二氮菲溶液、PBS液及双蒸水混均匀，每管加入硫酸亚铁溶液后立即混均匀，否则会使局部颜过浓，溶液颜不均匀，从而影响结果的稳定性。
五、结果计算
HO·清除率（d）：
d%=［（A样－A损伤）/（A未损伤－A损伤）］×100%
总的HO·的产生量：
△A536=A未损伤－A损伤黎氏三兄弟
加入样品后HO·的产生量：
△A536=A未损伤－A样
实验三还原力试验
实验原理[10]：还原能力的测定是以样品是否是良好的电子供应者为指标的。如果样品是良好的电子供体，其供应的电子不仅可以使Fe3+还原成Fe2+，还可以与自由基结合形成惰性的物质，从而达到中断自氧化链锁反应的目的。
操作过程[11]：在15mL的离心管中依次加入pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL，不同浓度的样品液2.5mL和1%的铁溶液2.5mL，混合均匀后，置于50℃
水浴中温育20min，然后迅速冷却（冬季：自来水，夏季：冰水浴），再加入10%的三2.5mL，混匀后，在3000r/min的条件下离心分离10min后，取上清液5mL于20mL的比管中，再加入蒸馏水4mL和0.1 %的三氯化铁1mL，混匀后，放置10min，在700nm处测定吸光度，吸光值越高，还原力越强。
参比（调零）：pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5 mL +不同浓度的样品液2.5mL+10%的三2.5mL+2.5mL水
清除超氧阴离子自由基的试验
超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产
生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。本研究采用邻苯三酚自氧化法进行试验。
. 实验原理[6]：邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有产物在325nm有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。
操作过程[7]：在10mL的比管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl 缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用8mo1/L的HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度，同时用1mL的蒸馏水代替样品液作为空白管。每管做三个重复，取平均值。并且同时用10mmol/L的盐酸0.3ml代替邻苯三酚溶液0.3mL作试剂空白。（空白管、样品管都要做，都要将试剂空白去除）
02﹣∙清除率（%）
× 100%
先配制成指定浓度（50mmol/L）的Tris-HCl 缓冲液，在加蒸馏水溶解时，首先加入小于计算所得的蒸馏水体积的蒸馏水，然后用HCl 或者NaOH 调节pH 至8.2 ，最后再用蒸馏
阀安格水处理系统水定容到指定体积即可。
Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L）
50毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与X毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100毫升。
pH (25℃) X (mL)
7.10 45.7
7.20 44.7
7.30 43.4
7.40 42.0
7.50 40.3
7.60 38.5
7.70 36.6
7.80 34.5
7.90 32.0
8.00 29.2
8.10 26.2
8.20 22.9
8.30 19.9
8.40 17.2
8.50 14.7
8.60 12.4
8.70 10.3
8.80 8.5
8.90 7.0
Tris分子量＝121.14 ；0.1 mol/L溶液为12.114 g/L。Tris溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。
50mmol/L PH8.2 Tris-HCl 缓冲液的配制：准确称取6.057g Tris样品，用蒸馏水定容于500ml容量瓶中，即为0.1mol/L Tris溶液，取250 ml此Tris溶液，再取114.5ml 0.01mol/L HCl溶液混合，调PH值至8.2并定容至500ml即可。
3mmol/L邻苯三酚溶液的配制：准确称取0.3783g邻苯三酚，用0.01mol/L HCl 溶液溶解定容至100ml，再取10ml此溶液定容至100ml即可。
0.1mol/LHCl 的配制：浓盐酸10mL加水稀释至1L。
2.2.
3.1树脂的处理方法
吸附树脂生产过程中一般均采用工业级原料，产品没有经过进一步净化处
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议