・基础研究・文章编号:1007-8738(2003)04-316-04
王大东1，李基业1，王金惠2，徐东刚2，焦华波1，李 涛1，邓 1，王嘉玺2，黎沾良1
(1解放军第304医院普通外科，北京100037;
2
军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)
收稿日期:2002-07-12; 修稿日期:2002-10-20基金项目：军事医学科学院创新基金资助(No.2000304004)作者简介：王大东(19642)，男，山东济南人，副主任医师，博士后.
Tel.(010)66867354,Email :wangdadong @263
Expression of a novel human inter 2leukin 213in E.coli and its biological activity assay
W A N G Da 2dong 1,L I Ji 2ye 1,W A N G Ji n 2hui 2
,X U Dong 2gang 2,J IA O Hua 2bo 1,L I Tao 1,D EN G Q un 1
,W A N G Jia 2xi 2,L I Zhan 2liang
1
1
Department of G eneral Surgery ,No.304Hos pital of PLA ,Bei 2
jing 100037;2
Institute of Basic Medical Sciences ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100850,China
Abstract
AIM :T o expre ss a novel G ln982deleted human interleukin li.METH ODS :T otal RNA was isolated from J urkat cells co stimulated with PH A and ConA.A 358bp 2specific DNA frag 2ment encoding hI L 213was amplified by semi 2ne sted RT 2PCR.DNA sequencing showed that the target DNA was a G ln982delet 2ed novel splicing of hI L 213.This hI L 213cDNA and plasmid pBV220were ligated at BamH I and EcoR I site s to construct
the expre ssion vector.A fter transforming E.coli strain DH 5
α,the expre ssion of the novel splicing hI L 213gene was induced by shifting culture temperature from 30℃to 42℃.The expre ssion product was then purified by chromatography on Sepharcryl 2200gel column ,and the bioactivity was detected by MTT colorime 2try on the growth of TF 21cell line.RESU LTS :The novel rhI L 213was expre ssed in the form of inclusion bodie s.A fter purification and renaturation ,the specific activity of the novel rhI L 213was 1.6×106
I U/mg.CONC L USION :The novel rhI L 213with bio 2logical activity has been obtained ,which lays the foundation for treating cancer and septicemia by the cytokine in future.K eyw ords :novel human interleukin 213;cloning ;prokaryotic ex 2
pre ssion
摘要
目的：在大肠杆菌中表达人白细胞介素213的新型拼接体蛋白。方法：用植物凝集素(PHA )和刀豆凝集素(ConA )共刺激人J urkat 细胞，通过半巢式RT 2PCR 扩增在98位缺失G ln 、不含信号肽的人IL 213新拼接体基因，并克隆入pBV220，构 建pBV IL 213表达载体，经温度诱导后在大肠杆菌DH5α中表达新型人IL 213蛋白。表达产物经S 2200纯化、复性后，用
TF 21细胞进行M TT 比测定其活性。结果：成功地分离了
人IL 213新拼接体基因，并在大肠杆菌中表达。分离纯化的新型IL 213蛋白，其比活性为1.6×106U/mg 。结论：获得具有生物学活性的新型人IL 213细胞因子，为用其肿瘤和脓毒症提供了新的手段。
关键词：新型人白细胞介素213；克隆；原核表达中图分类号:Q78 文献标识码:A
人白细胞介素213(human interleukin 213,hIL 213)具有多种生物学效应，可抑制单核2巨噬细胞产生促炎细胞因子和趋化性细胞因子，刺激B 细胞增殖、活化，诱导IgM 和IgG 产生和使Ig 重链转换为IgE 和IgG 4，以及间接诱导巨噬细胞和
N K 细胞，参与抗肿瘤免疫反应。因此,hIL 213具有抗炎、抗
肿瘤及参与变态反应性疾病等多种功能[1]。我们用semi 2
nested RT 2PCR ，从J urkat 细胞中分离出新型hIL 213拼接体基
因，构建了pBV IL 213的高效表达载体，并在 E.coli 中高效表达。通过对表达产物纯化和复性，获得了具有活性的新型
hIL 213蛋白，为肿瘤、脓毒血症的细胞因子提供了条件。
1 材料和方法
1.1 材料 E.coli DH5α、大肠杆菌表达载体pBV220，为本实验室保存菌种。T 2Easy 载体、Eco R I 、B am H I 、T4DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、RNAegnts Total RNA Isolation Sys 2
tem 、Access Introductory RT 2PCR System ，均购自Promega
公司。J urkat 细胞由军事医学科学院基础医学研究所刘荷中博士赠送。植物凝集素(PHA )、刀豆血凝素(ConA )、尿素、、三羟甲基氨基甲烷(Tris )及二硫苏糖醇(DTT )均购自Sigma 公司。RPMI1640购自G ibco 公司。分离纯化填料Sephacryl 2200购自Pharmacia 公司。TF 21细胞购自中国预防医学科学院病毒所。GM 2CSF 及rhIL 213标准品，购自瑞典Pharmacia 公司。
1.2 方法
1.2.1 新型人IL 213基因的扩增 用含100mL/L FCS 、2mol/L G ln 、5×104U/L 青霉素和50mg/L 链霉素的RPMI1640培养J urkat 细胞，细胞密度为108/L ，每周传代两
次。将PHA (1mg/L )ConA (10mg/L )超滤除菌后，每瓶各加
平安培训管理系统50μL 及1μL 连续培养3h ，提取总RNA 。根据文献[1、6],
设计P L1、P L2及P R 一对半引物。P L2引物5′端引入了Eco R I 位点及起始密码子A TG ，保护性硷基CG 。P R 引物引入
B am H I 及大肠杆菌偏性终止密码子TAA ，保护性硷基CG
C 。
引物由上海生物工程有限公司合成。引物的序列为:P L1:5′2
TTG,GCA CTG GGC CTC A TG23′;P L2:5′2CGG AA T TCA TA T GGG CCC TGT GCC TCC CTC T23′;P R:5′2CGC GG A TCC TTA GTT G AA CCG TCC CTC23′。经G oldenkey软件分析，无引物二聚体和发夹样结构形成。取5μL总RNA，以P L1、P R为引物，用Access Introductory RT2PCR system 扩增hIL213基因片段。反应混合物首先于48℃反应45min进行反转录，然后于94℃变性2min。先期以94℃变性30s,55℃退火45s,68℃延长2min，共5个循环。后期以94℃变性30 s,58℃退火1min,68℃延伸2min，共25个循环，最后1个循环于68℃延伸7min。扩增产物以15g/L琼脂糖凝胶电泳进行初步分析。取上次RT2PCR扩增产物3μL为模板，以P L2和P R为引物进行扩增，条件为94℃预变性2min,94℃变性30s,60℃退火1min,68℃延伸2min，共30个循环，最后1个循环于68℃延伸7min。取两次RT2PCR产物，再进行15g/L琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.2 新型人IL213基因的序列分析 PCR产物80μL，以15g/L琼脂糖凝胶电泳2h后，于紫外灯观察在358bp处有一明亮条带。切下该处条带，用PURIGEN E DNA快速纯化回收试剂盒回收DNA。取3μL与载体p GEM2T Easy连接后，转化感受态 E.coli DH5α。用Eco R I和B am H I酶切鉴定所提质粒，将阳性单菌落扩大培养后，取1.5mL菌液以Wizard Plus SVMinipreps DNA Purification System试剂盒精提取质粒，通过DNA自动测序仪进行序列分析。
1.2.3 原核表达载体的构建与表达 将扩增的hIl213片段和pBV220质粒DNA，均采用Eco R I/B am H I双酶切，并以DNA快速纯化回收试剂盒回收DNA。取pBV220的酶切大片段与hIL213基因以T4DNA连接酶低温连接过夜。取5μL 连接产物转化受体菌 E.coli DH5α。挑选具有氨苄青霉素抗性的菌落扩大培养，快速提取质粒，以Eco R I/B am H I双酶切后，用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定含有重组子的质粒。挑取含有重组质粒的单菌落，转接于3mL含Ap的LB培养基中,30℃过夜。次日，按3%的比例将转化菌接种于含Ap的LB培养基中，于30℃以180r/min离心，培养至对数期(A= 0.4～0.6)。然后，快速改为42℃200r/min离心，水浴培养4h，诱导新型人IL213基因在 E.coli中表达。
1.2.4 表达产物的纯化及复性 取2000mL的发酵物于4℃以4000r/min离心，取沉淀菌体悬浮于裂体液中，混匀，于冰浴中超声波粉碎(6×30s)。取沉淀，用9倍体积的10mL/L TritonX2100洗涤，再取少量包涵体分别用0.5、1.
0、2.0、3.0、4.0、5.0mol/L尿素(p H9.0)洗涤，挑选最佳尿素洗涤浓度为4.0mol/L。取等量经洗涤的包涵体溶于8 mol/L尿素中。用S2200为填料，柱体积3.6×100cm，以2倍柱体积的平衡液平衡24h，上样(约为柱体积的2%)，流速为30mL/h。以自动收集器分管收集洗脱液，进行150g/L SDS2PA GE鉴定。包涵体纯化后，加入复性缓冲液(50mmol/ L Tris及100mmol/L NaCl p H8.5)，同时加入PEG3350，使其与目的蛋白的摩尔比为6左右。同时加入1mmol还原型谷胱苷肽(GSH)和0.1mmol氧化型谷胱苷肽(GSSG)，于12℃放置48h后，对PBS透析去除尿素及PEG3350。1.2.5 新型人IL213活性的测定 取传代培养3d的TF21细胞，用RPMI1640培养液洗3次，调整细胞密度至4×1011/ L。在96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液和100μL倍比稀释的hIL213样品，设置3排。阳性对照孔中加入rh GM2 CSF标准品(最高浓度25U/孔)，阴性对照孔中加入含100 mL/L NCS的RPMI1640培养液。于37℃、50mL/L CO2饱和湿度下培养48h，加入40μL M TT溶液，继续培养过夜，再加入100μL DMSO裂解液终止反应。待孔内甲 颗粒完全溶解后，用酶联仪于波长540nm测定A值。
姬诚2 结果
2.1 新型人I L213基因的克隆 J urkat细胞经PHA、ConA 刺激后，提取总RNA，以分光光度计检测A260/A280=1. 8990,A280/A260=0.5266,RNA浓度=5.3mg/L。经甲醛变性的RNA电泳后，出现28S、18S及5S3条带。将提取的RNA进行RT2PCR扩增，扩增产物经第2次半巢式PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳后于358bp处有1条特异明亮的带(图1)
。
图1 人IL213DNA片段的半巢式PCR扩增
Fig1 Amplification of hIL213cDNA segment by semi2nested RT2PCR
1:PCR marker(pBR322/Hi n f I);2:hIL213cDNA.
2.2 新型人I L213基因的序列分析 将PCR扩增的基因片段与载体p GEM2T Easy连接后，转化 E.coli DH5α。提取质粒经Eco R I和B am H I酶切鉴定，可切出358bp的基因片段(图2)。目的基因测序后与标准IL213基因对比，在98位处缺少G ln为新型人IL213基因
。
图2 IL213cDNA的Eco R I B am H I酶切鉴定
Fig2 Identification of I L213cDNA by E co R I and Bam H I digestion 1:Marker(pBR322/Hin f I);2:T2Easy2IL213digested by Eco R I Bam H I; 3:PCR product of hIL213cDNA.
2.3 重组表达载体pBVI L 213的构建 在5′端从第1个核苷
酸开始，在其前面加上起始密码子A TG 和Eco R I 酶切位点，并在A TG 前面引入AA 来调整SD 组成
与A TG 间的距离，以提高转录与翻译的效率。在3′端引入大肠杆菌偏爱的终止密码子TAA 代替TA G ，并引入B am H I 酶切位点。
2.4 重组质粒在大肠杆菌中的表达 以大肠杆菌DH5α为宿主菌，电泳后显示重组质粒pBV IL 213经温度诱导在M r 为
12000处表达1条特异蛋白带，与理论值相符，而对照菌则无
固液分离装置此蛋白的表达。分别在诱导后3、4、5、6、7和8h 收菌，用
150g/L SDS 2PA GE 鉴定，在诱导4h 表达量最高,6h 后表达
量相对开始减少，最高表达量达全菌总蛋白的28%(图3)
。
图3 重组人IL 213表达的SDS 2PA GE 分析
Fig 3 Analysis of rhIL 213expression by SDS 2PA GE
1:Protein marker ;2,3,4,6,7,8:Expressions of hIL 213at 3,4,5,6,7and 8hours after induction ;5:Blank vector pBV220.
2.5 表达产物的纯化及复性 hIL 213含有4个Cys 和较多
的非极性氨基酸残基，形成的包涵体较致密、疏水性强，因此，在溶解包涵体时加入DTT ，以打断分子间与分子内错配形成的二硫键。pBV IL 213包涵体用10mL/L Triton X 2100和 4moL/L 尿素洗涤。根据hIL 213的M r 为12000，以Sephacryl 2200为填料，记录洗脱曲线，用自动部分收集器收
集后，进行150g/L SDS 2PA GE 鉴定各个洗脱峰组分。经薄层扫描鉴定，目的蛋白的纯度在87%(图4)。将pBV IL 213以
GSSG 为还原剂,GSH 为氧化剂(比例为10∶1至5∶1)，加入PEG 300，在5℃复性72h 并结合透析法逐步降低尿素浓度,
工程结算
得到较好的复性效果
膈下游离气体。
图4 S 2200纯化的人IL 213包涵体的SDS 2PA GE 分析
Fig 4 SDS 2PA GE analysis of inclusion bodies of IL 213purified
through sephacryl 2200gel filtration
1:Protein marker ;2,3,4,5:Purified hIL 213.
2.6 新型hI L 213活性的检测 根据TF 21细胞是GM 2CSF/hIL 213的依赖细胞，以M TT 比法测定hIL 213的活性。结
果表明，标准品GM 2CSF 与hIL 213对TF 21细胞的刺激反应一致。hIL 213的比活性相当于rh GM 2CSF 的1.6×106U/mg ，说明hIL 213具有较强的生物学活性(图5)
。
图5 hIL 213活性的M TT 法测定
Fig 5 The determination of hIL 213activity by M TT colorimetry
3 讨论
hIL 213基因定位于第5号染体5q 23.31，主要由活化
的Th2(CD4+)细胞分泌。hIL 213既对单核2巨噬细胞、B 细
胞具有诱导、分化作用，又可在变态反应性疾病和哮喘中引起气道高反应性、嗜酸性粒细胞性炎症、粘液分泌过多及基膜纤维化等[2,3]。利用DNA 重组技术大量生产有自主知识产权的
IL 213势在必行。国外是从人T 细胞cDNA 文库中，筛选全
序列IL 213基因并在CHO 细胞中表达[1]。在原核细胞中直接
表达出人新型IL 213尚未见报道。
人白血病J urkat 细胞虽可表达IL 213[4]，但表达量较低，直接克隆其基因较困难。利用半巢式PCR 技术，可克隆出在
98位点缺失G ln 的IL 213新拼接体[5]。
由于原核表达系统具有良好的可操作性及成本低廉等优点，已广泛得到使用。外源蛋白质在大肠杆菌中表达受很多因素影响。外源基因本身的结构特点使其在大肠杆菌中的表达水平有显著差别。对于pBV220,SD 序列距起始密码子6～9bp 时，外源蛋白的表达率很高，而且在起始密码子的前几个碱基为A 或T 时，可提高表达率[6]。减轻细胞代谢负荷，是提高外源基因表达水平的另一种方法。先以30℃培养，使宿主菌生物量积累到一定水平后，再提高温度至33℃诱导细胞中质粒DNA 的复制，增加质粒的拷贝数，最后升温至42℃诱导表达。拷贝数的增加必将伴随外源基因表达水平的提高[7]。温度诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达产物，常以包涵体的形式存在。包涵体是由于蛋白质分子不正确或不完全折叠，而在分子之间通过共价键或非共价键缔合而形成的致密、具有一定疏水性和无生物活性的颗粒物[8]。包涵体溶解后，用Sephacryl 2200纯化，目的蛋白纯度达87%以上。
hIL 213含有Cys 残基和二硫键，在复性溶液中加入GSH 和GSSG 可维持一定的氧化还原势能，通过巯基与二硫键之间
的互换可提高重组蛋白的复性效率[9]。结合透析法逐步降低尿素浓度，得到了较好的复性效果。
(下转第325页)
TNF2α空间构象结构的序列，更加有利于对受体-配基结合的构象分析及寻关键性残基，从而为制备小分子肽类药物提供依据。
由于小分子肽类药物存在半衰期短、亲和力较低等缺点，因而对小分子肽的改造和重新设计显得尤为重要。近年来，计算机辅助药物设计(CADD)以及生物信息学(bioinformatics)的发展，为小分子肽类药物的研究与开发开辟了广阔的前景。因此，在后续工作中，我们正在利用计算机辅助分子模拟技术对阳性克隆序列进行模拟分析，并拟合成TNF2α模拟短肽分子，对其生物学活性进行鉴定及更为深入的研究。
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(上接第318页)
纯化后的目的蛋白纯度达87%以上，可满足其生物学活性的测定及进一步研究的需要，同时为大规模生产新型hIL2 13提供了切实可行的生产工艺基础。体外生物学活性研究表明，新型hIL213能以剂量依赖性方式刺激TF21细胞增殖，具有野生型IL213的生物学活性。
我们首次成功地用普通原核表达体系，高效表达了具有生物学活性的新型rhIL213，对于抗炎、抗肿瘤的防治提供了有力的手段。
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