•346•中国防痨杂志 2021年4 月第43 卷第4 期C h i n J A m i t u b e r c.A p r i l 2021,V〇1.43，No. 1 .论著•
假阴性的相关因素分析
俞珊李志明许春霞王涛
【摘要】目的分析影响结核病患者外周血7干扰素释放试验（interferon-gam ma release assay，I(;R A)检测 假阴性的影响因素=方法回顾性分析2018年1月至2020年3月解放军总医院第八医学中心结核四科收治的资 料完整、外周血IG R A检测阴性和阳性的结核病患者，分别作为1G RA假阴性组（38例）和IG R A阳性组（119例），收集其一般情况、病史特点、血清生化指标和外周血淋巴细胞亚，采用单因素和多因素lo g istic回归分析导致 I(;R A检测结果假阴性的影响因素。结果IG R A假阴性组淋巴细胞计数、T细胞计数、C D4+T细胞计数、CD8' T 细胞计数、N K T 细胞计数 iW(Q, ,Q3)分别为 1. 15 ( 0. 77,1.58) X109个/L、867. 50(508. 75,1135. 50)个/>1、493. 00 (256. 00,673. 75)个/y、254. 50(170. 25,429. 25)个/p l、38. 50(16. 50,88. 25)个/fxl，均明显低于IGRA 阳性组[分别 为1. 46(0_ 99,1_ 88) X 109个".、1013. 00(667_ 00,1394. 00)个/；/丨、590. 00(386. 00,850. 00)个/>1、335. 00(232. 00, 561. 00)个4U57. 00(30. 00,121. 00)个/p i，差异均有统计学意义(Z值分别为一2. 512、一2. 143、一2. 092、一2. 3 03、—2. 338.P值分别为0. 012、0. 032、0. 036、0. 021、0• 019)。lo g istic回归分析结果显示，N K T细胞计数低于正常值 (<40个，⑷的患者，K;R A检测出现假阴性的风险是N K T细胞计数正常者的2. 440倍（95%C7:1. 159〜5. 134)。
结论N K T细胞计数的减少可能导致外周血IG R A出现假阴性。
【关键词】结核.肺；干扰素7；免疫学试验；因素分析，统计学
Analysis of risk factors associated with false negative results of interferon-gamma release assays on peripheral I)1<k k1from tuberculosis patients YU Shan , L I Zhi-mitig-, X U Chun-xia , WANG Tao. Department 4 of Tuberculosis Eighth Medical Center^ General Hospital oj Chinese Peopley s Liberation Antiy ■,Beijing 100091, China
Corres/jotiditig author ：WANG Tao ^ Email ：w tl97e)0728@hotmm l. com
【Abstract】Objective T o analyse the risk factors associated with false negative results of interferon-gamma release assays (IGRA) of peripheral blood from tuberculosis patients. Methods Wc performed a retrospective analysis using data from tuberculosis patients at TB Department 4 of the 8th Medical Center of the Chfnese Peopled Liberation A rm y General Hospital from January 2018 to March 2020 who had peripheral blood IGRA assay results.
They were divided into KiRA negative (38 patients) and IGRA positive (119 patients) groups. General information, medical history, serum biochemical indexes and peripheral T lymphocyte subpopulation data were collected. Single factor analysis and m ultivariate logistic regression analysis were performed to analyze risk factors associated with false negative I(j RA results in tuberculosis patients. Results The M(Q\) of lymphocyte count, T cell count,
C D4’T cell count，CD8 T cell count and N K T cell count for the negative group were 1. 15 (0• 77，1.58) X
10；)cells/L, 867.50 (508.75, 1135.50) cells//il, 493.00 (256.00, 673.75) cells/^1, 254.50 (170.25, 429.25) cells/fi\and 38. 50 (16.50，88.25) celLs//[il respectively, and were significantly lower than that of the positive gro u p：1.46 (0.99, 1.88)X109cells/L, 1013.00 (667.00, 1394.00) cells/^tl, 590.00 (386.00, 850.00) cells//il, 335.00 (232.00, 561.00) cells/^tl and 57.00 (30.00, 121.00) cells/^1 (th e Z values were —2.512, 一2. 143, — 2.092，一2.303 and —2. 338，and the P values w ere 0.012，0.032，0.036，0.021 and 0.019 respectively).
铬酸盐钝化Logistic regrevssion analysis indicated that patients w ith NKT cell counts that were lower than normal (<C40 cells//Ltl) had a 2. 440 times higher risk (95%C/：1. 159—5. 134) than those w ith a n
ormal N K T cell count of having a false negative ICiRA result. Conclusion Lowered N K T cell counts may be a contributing factor leading to false negative peripheral blood IGRA results.
【K eyw ords】TuhcrculosivS，pulmonary; Interferon-gamma ；Immunologic tests；Factor analysis, statistical
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doi： 10. 3969/j. issn. 1000-6621. 2021. 04. 009
作者单位：100091北京，中国人民解放军总医院第八医学中心 结核四科
通信作者：王涛，
Email:**********************
外周血"/干扰素释放试验（interferon -g a m m a
release as s a y ，I G R A
)是一种检测结核分枝杆菌感
染的免疫诊断技术。检测原理是人体感染结核分枝
杆菌后，产生记忆性T 淋巴细胞，当特异性结核抗 原再次人侵时，记忆细胞就会迅速增殖活化形成大 量的效应T 淋巴细胞，释放干扰素（I F N -7)。
I G R A
通过测定I F N -7或能够释放I F N -7的效应T
细胞来判断体内是否存在结核分枝杆菌感染[1]。钱
宏波等[2]研究表明，I G R A 对结核感染检测的敏感 度为81. 7%〜97. 1%，特异度为75. 2%〜95. 6%。 临床上有一部分患者虽然从痰液或脓液涂片中能够 到抗酸杆菌，或者通过分子生物学、病理
学能够明 确诊断为结核病，但是其外周血I G R A 检测为阴 性。本研究收集2018年1月至2020年3月解放军 总医院第八医学中心结核四科收治的诊断明确、资 料完整的38例外周血I G R A 检测阴性结核病患者 的资料，与同期收治的119例
I G R A
检测阳性结核
病患者的资料进行对照，分析可能导致外周血
I G R A 检测假阴性的影响因素。
资料和方法
一、资料收集
1. 研究对象：2018年1月至2020年3月解放 军总医院第八医学中心收治的符合纳人和排除标
准，资料完整的157例结核病患者。
2.
纳入标准：（1)年龄18〜70岁；（2)结核病诊断明确：符合中华人民共和国国家卫生和计划生育
委员会发布的《W S 288—2017诊断》[3]和
《W S
196—2017结核病分类》[4]：通过标本抗酸染、
分子生物学、培养或病理明确诊断为结核病患者。3. 排除标准：（1)并发免疫系统相关疾病或肿
瘤；（2)进行骨髓或器官移植；（3)长期大量使用糖皮 质激素或免疫抑制剂；（4)标本培养或菌种鉴定为非 结核分枝杆菌；（5)存在心、肺、脑、肝、肾严重损伤； (6)孕期或哺乳期妇女；（7) H I V
感染者及A
I D S
患
者以8)未收集到完整资料。
4.
分组情况：按照I
G R A 检测结果分为〗G
R A
假阴性组和I G R A 阳性组。最终纳入结核病患者 157例，其中I G R A
假阴性组38例，I G
R A
阳性组
119 例。
二、纳入患者一般资料
157例患者中，男102例，女55例；年龄中位数 (四分位数）“％(〇,，Q 3 )”44. 0(29. 0,58. 0)岁，病程
M C Q
^
Q s
) 3. 0(1. 1,7.0)个月。I G R A 假阴性组
38例，其中，男24例，女14例，年龄M
(Q ,，Q 3)
46.5(29. 5, 63. 2)岁，病程 M C Q
h
Q
s
) 3.* 5 (1.0,
7. 8)个月。I
G R A
阳性组119例，其中，男78例，女
41 例，年龄 M (Q ,，Q 3) 42. 0(29.0,56.0)岁，病程 M (Q m Q 3) 3.0(1. 1，7.0)个月。两组患者性别、年 龄、史、采血前抗结核时间、病灶部位、耐药
情况、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史、结核抗体检测等
刘桂苏
方面差异均无统计学意义，具有可比性(表1)。
元极舞
表1
两组患者基本情况比较
IGRA 假阴性组(38例)2012皮鞋很忙
IG RA 阳性组（119例）
f 值P 值例数
构成比（％)
例数
构成比（％)
性别0.072
0. 788
男2463.27865.5女14
36. 8
41
34.5
年龄组(岁）
0. 328
0. 567
<502155. 36857. 150 〜70
17
44. 7
51
42.9
史0.044
0. 835
初治3489.510588.2复治
4
10. 5
14
11.8
采血前抗结核时间
0. 462
0. 497
<4周1950.06756.3>4周
19
50.0
52
43. 7
续表1
基本情况IGRA假阴性组(38例）IGRA阳性组（119例）
f值P值例数构成比（％)例数构成比（％)
病灶部位 2.1160. 1462257.98470. 6
肺外结核1642. 13529.4
耐药情况0. 4340.510是37.96 5. 0
否3592. 111395.0
糖尿病病史0. 7480.387是513. 22319.3
否3386.89680.7
吸烟史 1. 1210. 290是923. 73932.8
否2976.38067. 2
饮酒史 2. 5210. 112是2 5. 31815. 1
否3694. 710184. 9
sony w1结核抗体0. 3010.583阴性2360. 56655. 5
阳性1539. 55344. 5
三、检测方法
收集确诊患者本次住院則外周血I G R A、
C A125、血红细胞沉降率(E S R)、C反应蛋白（C R P)和T细胞亚结果。
1.I G R A检测：采用北京万泰生物药业股份有
限公司生产的血I G R A测定试剂盒（体外释放酶联
免疫吸附法)检测外周血I G R A。结果判定标准：按
照试剂盒说明书进行，每个测试分为“N—阴性孔”
“T一检测孔”“P—阳性孔”3个孔。N孔检测体内
基础I F N-y含量，T孔检测经结核分枝杆菌特异性
抗原刺激全血后，被结核分枝杆菌感染的特异性T
细胞释放的I F N-y含量.P孔检测植物血凝素
(P H A)非特异性刺激全血中T细胞释放的I F N-7
含量，当T管与N管含量差值（T—?«〇>14且> N/4时，结果判定为阳性；当T一N<14时，结果判 定为阴性。
2.C A125检测：采用美国贝克曼库尔特UniCel
D x l800全自动化学发光免疫分析仪检测C A125在 血清中的浓度(正常参考值:〇〜35 U/L)。
3.E S R检测：采用魏氏法检测E S R(正常参考值:0〜20 m m/1 h)。
4.C R P检测：采用美国贝克曼库尔特A U5800
全自动生化分析仪检测C R P在血浆中的浓度(正常
参考值:0〜4 m g/L)。
5.T细胞亚检测：采用美国贝克顿-迪金森
公司分选式流式细胞仪检测外周血T细胞、C D4+
T细胞、C D8+ T细胞、C D4+ T/C D8+ T、自然杀伤
T细胞（natural killer T，N K T细胞）、自然杀伤细
胞(N K细胞)及B细胞计数和百分比(正常参考值：
T细胞计数966〜2860个/fxl，T细胞百分比0•50〜 0•84,C D4+ T细胞计数 550〜1440 个/fxl，C D4+ T
细胞百分比〇•27〜0.51,C D8+ T细胞计数320〜1250 个/M1,C D8+ T 细胞百分比0• 15 〜0.44，
C D4+T/C D8+T 0•71 〜2.78,N K 细胞计数 150〜 1100个/f z U N K细胞百分比0.07〜0• 14，N K T细
胞计数40〜300个化1，N K T细胞百分比0•02〜 0• 13，B细胞计数90〜560个/^1,B细胞百分比0•05 〜0• 18)。
6.淋巴细胞检测：采用法国A B X公司A B X P E N T R A D F 120全自动五分类血细胞分析仪检测
淋巴细胞计数及百分比[正常参考值：淋巴细胞计数
(0.8〜4)X109/L，淋巴细胞百分比20%〜40%]。
四、统计学处理
采用SPSS26. 0软件进行统计学分析。本研究 计量资料呈偏态分布，以表示，采用 Marm-Whitney U检验进行组间比较；计数资料采 用“例数”和“构成比（％)”表示，采用/检验进行组 间比较。以IG R A检测结果（阳性和假阴性）为因 变量，采用多因素logistic回归分析与IG RA检测 出现假阴性有关的因素，采用逐步法进行变量筛选。以P<0. 05为差异有统计学意义。
结 果
一、两组患者血清生化指标的比较
两组患者0八125、[31^、〇^、淋巴细胞百分比差异均无统计学意义;IG R A假阴性组淋巴细胞计 数明显少于IG R A阳性组，差异有统计学意义。见表2。
二、 两组患者T细胞亚检测结果
IGRA假阴性组患者T细胞计数、CD4+T细胞 计数、CD8+T细胞计数和N K T细胞计数均明显低 于IG R A阳性组，差异均有统计学意义。见表3。
三、 多因素分析
玛坤丝将IGRA假阴性组和IG R A阳性组差异有统 计学意义的指标，包括淋巴细胞计数、T细胞计数、CD4+T细胞计数、C D8+T细胞计数、N K T细胞计 数纳入进行logistic回归分析，以正常值为参照进 行变量赋值(表4)。结果显示，N K T细胞计数低于 正常值(<40个/卩1)的患者，IGRA检测出现假阴性 的风险是NKT细胞计数正常者的2. 440倍。见表5。
表2各血清生化指标水平在两组患者中的比较[iVKQ,，〇〇]
血清生化指标IGRA假阴性组(38例）IGRA阳性组（119例）Z值P值CA125(U/ml)36. 08(20. 69,90.69)41.50(14. 80,107. 90)—0. 0900. 928 ESR(mm/l h)31.00(12. 25,76. 50)33.00(15.00,67.00)—0. 1990. 842 CRP(mg/L)34. 12(10. 79,71. 36)27.35(4. 09,63. 70)—1. 3090. 190淋巴细胞计数（X i o v u 1. 15(0.77,1. 58) 1.46(0. 99,1.88)—2. 5120. 012淋巴细胞百分比（％)21.32(12.01,27. 45)22.30(14. 30,30.54)— 1.0780.281
注正常参考值:CA125 0~35 U/L，ESR 0~20m m/l h,CRP 0〜 4 m g/L，淋巴细胞计数(0. 8~4)X109/L，淋巴细胞百分比20%〜40%
表3各T细胞亚水平在两组患者中的比较[JVKQ，Q3)]
T细胞亚分类IGRA假阴性组IGRA阳性组Z值P值T细胞计数（个“1)867. 50(508.75,1135. 50)1013.00
(667.00,1394. 00)—2. 1430. 032 T细胞百分比0.71 (0. 64,0.78)0.73(0. 67,0. 79)—1. 1070.268 CD4+T细胞计数（个/M l)493.00(256. 00,673. 75)590.00(386. 00,850. 00)_2. 0920.036 CD4+T细胞百分比0. 41(0.35,0.50)0. 41(0. 36,0. 49)一0.2190. 826 CD8+T细胞计数(个/M l)254.50(170.25,429. 25)335.00(232. 00,561.00)—2. 3030.021 CD8+T细胞百分比0. 23(0. 19,0. 31)0. 27(0. 21,0. 32)—1. 4920. 136 CD4+/CD8+ 1. 79(1. 21,2. 51) 1.58(1. 30,2.20)—0. 4730. 636 N K细胞计数(个“1)109. 00(71. 25,165. 25)138.00(86. 00,194. 00)-1. 8340. 067 N K细胞百分比0. 11(0. 07,0.17)0. 09(0. 06,0. 16)-1. 2480.212 N KT细胞计数(个/M l)38. 50(16. 50,88.25)57. 00(30. 00,121.00)-2. 3380.019 N KT细胞百分比0.03(0.02,0.06)0.05(0. 02,0. 08)—1. 6170. 106 B细胞计数（个/M l)100. 00(57. 75,238. 75)168. 00 (79. 00,271. 00)-1.4330. 149 B细胞百分比0.15(0. 07,0.19)0. 13(0. 08,0.17)-0. 8300.407
注正常参考值:T细胞计数〜286〇个〜1，丁细胞百分比0.50〜0.84，CD4+ T细胞计数550〜1M0个/m1，CD4+ T细胞百分比0.27〜 0. 51XD8+ T 细胞计数 320~1250 个41X08+T 细胞百分比 0. 15〜0. 44，CD4+T/CD8+T 0. 71 〜2. 78,NK 细胞计数 150~1100 个/m1,NK 细胞百分比0. 〇7〜0. 14，N K T细胞计数4〇〜300个/f J，N K T细胞百分比0• 02~0. 13,B细胞计数90〜560个细胞百分比0. 05〜0. 18
表4变量赋值表
变量赋值变量赋值
IGRA
淋巴细胞计数（X10VL) T细胞计数(个/M l)1=假阴性;0=阳性
〇=正常(>〇.8);1 =低于正常值(<0.8)
〇=正常（>966);1 =低于正常值(<966)
C D T T细胞计数（个〜1)
CD8+T细胞计数(个/M l)
NKT细胞计数(个/pi)
〇 =正常（>550);1
〇=正常〇320);1
〇=正常〇40);1 =
=低于正常值(<550)
=低于正常值(<320)
低于正常值（<40)表5结核病患者IG R A检测假阴性影响因素的lo g istic多因素回归分析
指标值57■值值P值（JR(95%C7)值N K T细胞
正常040个/p i)81
低F正常值（<4〇个/fJ) 0.892 0.380 5.520 0.019 2. 440(1. 159〜5. 134)注为参照
讨 论
IGRA是通过结核分枝杆菌特异性抗原刺激外 周血淋巴细胞，然后检测结核分枝杆菌抗原特异性 T细胞产生的IFN-y，用以判定是否存在结核分枝 杆菌感染[1’:|。目前主要有两种IG R A检测方法：(1) 应用ELISA方法检测全血样本被结核分枝杆菌 特异性抗原刺激后T细胞产生IFN-y的水平。
(2) 运用酶联免疫斑点技术（61^1110"1丨111^(1丨1：111111-nospol assay，ELISP()T)检测被结核分枝杆菌特异 性抗原刺激后能够释放IFN-7的T细胞计数。当外周血淋巴细胞计数少于〇•5 X109/L时，ELISP( )T敏感度明显高于ELISA[2]，本研究外周 血淋巴细胞均大于〇• 5X109/L，故采用第一种检测 方法。IG R A对于结核感染检测的敏感度为81.7%〜97.1%，特异度为75.2%〜95.6%[2]，明 显高于
结核菌素皮肤试验、结核抗体检测，以及病原 学、分子生物学和病理检测效率，且不受既往卡介苗 及糖皮质激素的影响.但仍存在一定比例的假 阴性。
研究者对IG RA假阴性的影响因素结论不完 全一致。Yamasue等[6]提出，高龄和低外周血淋巴 细胞计数可能是IG R A假阴性结果的常见危险因 素。Nguyen等d提出，高龄、HIV感染、非西班牙 裔白种人与IG RA阴性结果相关，且IGRA结果为 阴性的结核病患者死亡率较高，推测原因是延 迟。钱宏波等21通过对387例艾滋病患者的检测结 果进行分析，发现艾滋病患者外周血C I)4+T淋巴 细胞计数<50个时IG R A阳性率明显下降。同样全文和陆兴w提出，在艾滋病并发结核病患者中，CD4 'T淋巴细胞计数对TB-IGRA的阳性率有明 显影响，对于CD41T淋巴细胞计数较低的患者，尤 其是<50个/M1的患者，IG R A的敏感度明显降低。Pai等W提出，CD4 + T细胞和CD8+ T细胞明显低 于正常范围的患者容易出现1G R A的假阴性结果。但是童凤军等[1°]提出IFN-y在H IV与M TB双重 感染者中有较高表达，IFN-7水平在抗结核过 程中呈现下降趋势，但是其与T淋巴细胞计 数未见相关性。K im等[11=提出，肺外结核的1GRA 假阴性率可达28.8%，尤其是胸膜及骨结核。D i和亦提出肺外结核（如胸膜、骨结核及中枢神经 系统结核）的假阴性比例明显高于。Samos 等[13]提出，年龄超过70岁和酗酒是IGRA 阴性的影响因素，而肺外结核IGRA不受影响。丁 兴龙等[14]提出1G R A对矽肺并发及肺外结 核的诊断敏感度一致。钟华清等:15]通过对2200例 非结核病患儿及34例活动性结核病患儿进行回顾 性研究，发现IG RA检测结果与性别、年龄、卡介苗 接种史、结核病接触史、
机体免疫状态和感染部位无 关。巫丽兰和谭守勇[16]提出IGRA检测结果不受 低蛋白血症影响。徐瑶等[17]认为，初治抗结核 2个月后IG R A的阳性率可能逐渐下降，但仍无法 鉴别结核分枝杆菌潜伏感染及活动分期。综上所 述，IGRA的检测结果受到多种因素的影响，如何分 析和应用这个检测结果是临床诊断过程的一个 热点问题。
本研究已经排除已知的年龄过大、免疫抑制和 肿瘤等影响因素，发现IG RA假阴性组和阳性组在 性别、年龄、结核病灶部位、初复治、耐药情况、采血 前抗结核时间、糖尿病病史、吸烟史方面差异均 无统计学意义，并且两组患者ESR、CRP、CA125、*
巴细胞百分比等化验指标差异亦均无统计学意义。
人体对结核分枝杆菌的免疫防御反应分为先天 性免疫和适应性免疫。N K细胞是先天性免疫的主 要参与者，T淋巴细胞是适应性免疫的代表[18]。T细胞主要由CD4 —和CD8+T细胞组成。《结核病
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