禽流感血凝-血凝抑制试验操作方法及注意事项
禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、 血凝试验操作程序
1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。 七月的天山教学设计 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）
二、血凝抑制试验操作程序
1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4）
2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。
3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀
释至第12孔，弃去25 μL。
4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。
6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。
7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。 将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。
三、试验过程中的注意事项
1样品的保存及试验前处理
1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧烈震动。
1.2 一般情况下，在5天内检测的样品可放置在4℃的冰箱中冷藏，否则低温冷冻保存。
1.3 在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采用上下缓慢颠倒几次的方法即可，切忌剧烈振荡而引起产生气泡及血清中蛋白变性。
1.4 对出现胶冻状的血清样品，可采用反复搅动几下再离心的方法有助于缓解该状态。胶状物是含纤维蛋白和纤维蛋白原的血清，可能是由于放置时间不够造成的血清未完全析出状态。不建议直接吸取其中少量的清亮血清。
中国传媒大学高等职业技术学院 1.5 水禽等样品为排除非特异性反应，还应相应进行灭能反应。具体操作方法：56℃水浴锅30min或加等量10%鸡红细胞，轻摇后静置30分钟，离心，收集上清液即可。
2器材的选择国家突发公共事件总体应急预案
2.1 酶标板的选择：
建议使用96孔90°V型板进行试验，通过反复试验证明：90°V型板相对于110°板及130°板来讲，具有红细胞沉降速度快，产生的凝集图像清晰、结果容易判定等优点。林木和林地权属登记管理办法
2.2 移液的选择及使用：
①单道、多道可调微量移液应选择合适的量程，以便精确度的提高。
②使用时应采用一档吸液二档排液的方法。吸取液体时，头要深入液下缓慢平稳吸液。加缓冲液时
应加在板孔底部。倍比稀释血清时，应每孔至少反复吹吸6次，以便混合均匀，还应注意尽量避免产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时应在板内液面上方加样，以免交叉污染，影响试验结果。
通化师范学院学报 ③加样、倍比稀释时应高度集中注意力，以免漏加、重复加样等。
3试剂的保存及配置
3.1 禽流感血凝抑制试验所用的抗原、阳性血清应严格按照说明书的要求进行保存和配
置，试验前应提前将其恢复至室内温。抗原的保存温度为-20℃，反复冻融会降低抗原的滴度，应避免反复冻融。
3.2 PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制备
①应尽量现用现配
②每次使用前应测PH值，以免时间过长而导致PH值发生改变。
③由于PH试纸跨度范围偏大，PH值不易准确介定，因此最好采用酸度计准确测量PH值，以提高试验的精确度。
④全部试验均采用同一种稀释液。
3.3 1%红细胞的制备人造神
①为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好选择采取2-3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。当然采血的前提条件是要按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝剂，如肝素、枸椽酸钠、柠檬酸钠等。
②采血完毕后最好分装至2ml容量的圆底离心管中，因为通过2ml与1.5ml两种容量离心管相比较，放入1.5ml尖底离心管中的话，离心后，离心管底部红细胞不易与加入的PBS液混匀，易沉积在管底部，达不到洗脱干净的目的。
③经2000~3000r/min，5~10min，弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。
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