能测定
21卷5期
2005年9月
生物工程
ChineseJournalofBiotechnology
V01.2lNo.5
September2005
抗人CD19单链抗体基因的构建，表达及功能测定ConstructionandExpressionofSingleChainVariable
Fragments(ScFv)AgainstHumanCD19Antigen
陈森，饶青，王建祥，王敏
CHENSen,RAOQing,WANGJian—XiangandWANGMin
中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院，天津300020 InstituteofHematologyandBloodDiseasesHospital,ChineseAcademyofM edicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Tianjin300020,China
摘要采用RT.PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出v和v.可变区基
冠心病的护理计划因，再通过重叠延伸拼接(splice—overlapextension)PCR方法在vH和
V.可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3，体外构建抗人
CD19单链抗体(抗CD19一ScFv)基因.将其克隆至表达载体PET28a 并在大肠杆菌中表达.SDS—PAGE和Western—blot分析结果
表明，抗CDI9一SeFv在BL21(DE3)菌中获得表达，重组蛋白的相对分子量为27kD，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶马绿家
解包涵体，镍柱亲和层析纯化和体外复性过程，获得了高纯度的单链抗体片段.流式细胞分析结果证实抗CD19一ScFv可与人
类白细胞表面的分化抗原CD19结合，保留了鼠源性单抗与CD19结合活性.抗人CD19一ScFv的构建与表达，为下一步针对B
淋巴系统恶性肿瘤的靶向奠定了基础.
关键词CD19，单链抗体(ScFv)，原核表达
中图分类号Q786文献标识码A文章编号1000—3061(2005)05—0686—06 AbstractThegenesencodingforthelightandheavychainvariableregionswer eclonedbyRT—PCRfromamurinemonoclonal
中国儿童网hybridomacellline,whichcouldproducemonoclonalantibodytorecognize CD19antigenonhumanBlymphocyte.Thenfused thelightandheavychainvariableregionstogetherbyashortpeptidelinkercon taining15aminoacid(G1y4Set)3usingsplice—overlapextensivePCR.Therecombinantanti—CD19一liB121.SDS—PAGEandWesternblotanalysissh
owedthattherecombinantanti—CD19一liBI21.ScFvexpressionwasinth
eforlnofaninclusionb odiesandthepurifiedfusionproteinwas obtainedafteraseriesofpurificationstepsincludingcellbreak,inclusionbody solubilization,Nimetalaffinity chromatographyandproteinrefolding.Flowcytometryanalysisshowedthat theScFvcanreactwithhumanCD19antigen.In
conclusion,recombinantanti—CD19一ScFvgenehasbeenSuccessfulconstructedandexpressedinE.c0如B121.whichcould provideabasicstudyforthefuturetargettherapytotheBlymphoidleukemiaan dBlymphoma.
KeywordsCD19,ScFv,prokaryoticexpression
应用基因工程抗体进行肿瘤免疫是当前生
物的研究热点之一.CD19分子是B淋巴细胞
表面的一种分化抗原…，在B淋巴系统恶性肿瘤如
前卫体协急性淋巴细胞白血病，非何杰金氏淋巴瘤中广泛表
Received:April25,2005;Accepted:July2,2005. ThisworkwassupportedbythegrantsfromTianjin(No.033
801311)andTian jinNaturalScienceFundKeyTackleProject(No.05YFSZSF02400)
*Correspondingauthor.Tel:86-22-27307938～3169;E-mail:*******************
天津市应用基础研究重点项目(No033801311)，天津市科技发展计划项目(No.05YFSZSF02400).
陈森等：抗人CD19单链抗体基因的构建，表达及功能测定687 达].而在造血干细胞，浆细胞,T细胞及其他组织
中则没有表达.上述特点使其成为一种理想的靶向
的靶点’’.但由于鼠源性单抗具有较高的免到家网
疫原性，多次用药易产生人抗鼠抗体反应，限制了其
在I临床的应用.而单链抗体(ScFv)因其具有分子量
小，穿透力强，能较好的保持抗原亲和性及特异性同
时降低免疫原性等特点，已成为当前肿瘤免疫
中的一种重要手段.为此我们将鼠源性单克隆抗体
经基因工程方法改造成单链抗体，并成功地在大肠
杆菌中进行了功能性表达.抗CD19单链抗体的构
建为下一步针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向
奠定了基础.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1细胞与菌株：抗人CD19单克隆抗体的杂交
瘤细胞株HI19a，由中国医学科学院血液学研究所
自行研制.原核表达载体pET28a(+)和大肠杆菌
BL21(DE3)购自Novagen公司,pMD一18T载体，大肠 杆菌DH5a购自大连TaKaRa公司.
1.1.2试剂：限制酶,MML V逆转录酶及高保真pymbest聚合酶购自大连TaKaRa公司;Trizol试剂盒购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品；纯化镍柱购自Novagen公司；尿素,
盐酸胍，精氨酸盐酸购自上海生工生物工程有限公司.鼠抗His—tag抗体为Novagen公司产品;PE标记的兔抗鼠IgG为协和干细胞公司产品.
1.1.3PCR引物：为扩增抗体轻重链可变区基因通
用兼并引物，引物均由上海生工公司合成，画线部分为酶切位点.
表1PCR扩增所用的引物及其序列
Table1PrimersequencesusedforthePCRampUcation 5.GACAITrGTGCTCACCCAGWCTSMH.3
5.CCGrrAGA TCTCCARBITrKGTSCS一3
5.CAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG.3
勇往直前20095’GAGGAGAC(GTGACCGTGGTCCCITrGGCC CC.3
5CGGAA TTCGACAITrGTGCTCACCCAGTCT CCA.3
5-GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACC CCG1fIfrTA TTTCCACCITrGGTCCC.3
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